172238. lajstromszámú szabadalom • Eljárás klavicepaminok előállítására
9 172238 10 egyik csoportot kezeljük a termékkel, a másik csoport képezi a kezeletlen kontrollt. A kezelést a transzplantációt követő harmadik napon kezdjük. A kezelést 100 mg/testsúlykg Tween 80-nal fiziológiás nátrium-kloridban szuszpendált és 0,1 n nátrium-hidroxiddal neutralizált termékkel végezzük naponta, 10 napon keresztül intraperitonealisan. A kezelési periódus után az állatokat (a kontroll csoporthoz tartozó patkányokkal együtt) leöljük, a tumorokat kipreparáljuk és lemérjük a kipreparált daganatok súlyát. Eredmények : Kezelt Kontroll Átlagos tumorsúly 7,0 g/állat 25,0 g/állat d) Peros kezelés hatása subcutan oltott Yoshida patkány sarcoma növekedésére. Ac) pont szerinti kísérleti körülmények között dolgozunk azzal a különbséggel, hogy per os adagoljuk a terméket. A kezelést a transzplantáció utáni 3. napon kezdjük, és 10 napon keresztül adunk 100 mg/testsúlykg terméket az állatoknak gyomorszonda segítségével. A kezelt és a kontroll állatokat a 10 napos kezelés befejeztével leöljük és mérjük a kipreparált daganatok súlyát. Eredmények : Kezelt Kontroll Átlagos tumorsúly 25,4 g/állat 25,0 g/állat A kísérletek eredménye szerint intraperitoneális kezeléssel Ehrlich ascites tumoron 90%-os, Yoshida sarcoma-n 70%-os gátlás mérhető. Subcutan kezeléssel ascites tumoron 50%-os gátlás jelentkezik. Per os kezeléssel Yoshida sarcoma-ra nincs hatás. 4. példa Az OKI nemzeti törzsgyűjteményében 56/1970. szám alatt letétbe helyezett Claviceps purpurea törzs burgonyás ferde tenyészetét 3 literes Erlenmeyer lombikokban sterilezett 1000 ml táptalajra oltjuk, melynek összetétele az alábbi : 60 g glukóz 10 g hidrolizált kazein ad 1000 ml desztillált víz. Öt lombik egyesített tartalmát az alábbi táptalajra oltjuk át: 50.0 g L-szorbit 36.0 g borostyánkősav 2,0 g kálium-dihidrogén-foszfát 0,1 g magnézium-szulfát. 7 H20 ad 1000 ml ioncserélt víz, 180 1 táptalaj pH értékét ammónium-hidroxid oldattal 5,8-ra állítjuk és azt 200 1-es saválló, levegőztetett, keverős fermentorban sterilezzük. A tenyészetet 9 napig 24 °C-on inkubáljuk. A fermentáció után a micéliumot kamrás szeparátoron elválasztjuk. A 175 liter micéliummentesített fermentléhez 45 s%-ig ammónium-szulfátot adagolunk, az oldatot egy éjjelen át hűtve ( -f 10 °C alatt) a kivált nyersterméket elkülönítjük. A kapott 450 g nyerstermékből 50 g-ot 12 órán át desztillált vízzel szemben dializálunk, majd a dializáló hüvelyben maradt oldat pH-értékét 6,5-re állítjuk, ezt követően 1: 1,5 térfogatarányban etanolt adagolunk hozzá. A kivált csapadékot centrifugáljuk, majd a kapott 10 g nyers fehérjét 100 ml desztillált vízben oldjuk. Az oldhatatlan részt eltávolítjuk, az oldathoz három lépésben növekvő koncentrációban (10, 30 és 50 s%) ammónium-szulfátot adagolunk. Az egyes koncentrációknál levált csapadékot Sephadex G25 (fine) oszlopon sómentesítjük. A sómentesítő puffer-oldat összetétele 2 ml tömény ammónium-hidroxid oldat, 8 ml 96%-os hangyasav 1000 ml vízben. Az eluátumokat Seitz EK lapon végzett szűrés után liofilizáljuk. A sorrendben a, b és c jelzéssel ellátott termék kémiai és biológiai jellemzői, ahol az a termék az 1—6. frakció elegye, amely nagy molekulasúlyú szennyező fehérjéket is tartalmaz, a b termék az 1—7. és a c tennék a 3—9. frakció elegye, az alábbiak : a b c Lizin mól% N6-metil-arginin 37,1 44,8 74,4 mól% 0,6 1,0 1,5 Molekulasúly 10—30 000 8—17 000 4—15 000 A kapott termékek biológiai hatását az alábbi módszerrel mutatjuk be : A kísérlethez 30 db átlagosan 25 g testsúlyú Swiss fehér egeret használunk fel. Az állatokat 7 napos Nk/Ly ascites tumorral oltjuk be, a transzplantáció 5 X106 sejtszámmal történik. A kísérleti állatokat 6 csoportra osztjuk. Csoportonként 5—5 állaton végezzük el a kezelést az a, b és c jelzésű termékekkel, és 5 állat képezi a kontroli-csoportot. A kezelést a tumor-transzplantációt követő második napon kezdjük el. A Tween 80-nal nátrium-kloridban szuszpendált a, b és c jelzésű termékeket 100 mg/testsúlykg dózisban intraperitonealisan adjuk a kísérleti állatoknak 8 napon keresztül. A transzplantációt követő 9. napon az állatokat leöljük, megmérjük a hasüregben talált ascites mennyiségét és a sejtszámot. Eredmények : a b c kontroll Ascites folyadék (ml) 1 0 0 5 Sejtszám/ml 3,6 X107 0 0 9,6 X 107 Sejt/állat 3,6 X 107 0 0 4,8 X 108 5. példa 500 g 0,6% összalkaloidtartalmú, a 112 741 számú magyar szabadalmi leírásban ismertetett módon termesztett, a Gyógynövény Kutató Intézet által nemesített, BK 4 jelzésű, főleg ergotamint termelő Claviceps purpurea szkleróciumot hidegen először 1500 ml acetonnal, majd 1500 ml aceton és 150 ml 5%-os nátriumhidrogénkarbonát-oldat elegyével alkaloid- és zsírmentesítünk. Az így extrahált drogot két ízben 700 ml 0,9%-os nátrium-klorid oldattal hidegen pépesítjük és a pépet 1 órás állás után hűtés mellett centrifugáljuk. Az egyesített tisztára szűrt oldathoz 1: 1 arányban etanolt adunk. Az oldatból kivált csapadékot centrifugálással tömörítjük. A felülúszót elöntjük és a kapott nedves csapadékot etanolos mosással szárítjuk. 0,56 g száraz, nyers preparátumhoz jutunk. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 5
