172209. lajstromszámú szabadalom • Eljárás az antraciklin-glikozidjellegű aklacinomicin a és b tumorellenes antibiotikum előállítására
13 172209 14 mangán(II)szulfát-tetrahidrát és 0,0002% cink-szulfát-pentahidrát, pH 6,9-es értéknél végeztük a tenyésztést, a táptalaj pH-ja az átoltást követő 20 óra múlva 5,25— 5,10-re csökkent, és a micélium növekedése 10 óra múlva nagyobb mérvű lett. Ezután a pH 3 nap alatt 7,0—7,5-re emelkedett, és az aklacinomicin A és B koncentrációja a tenyészlében elérte a maximális értéket, ez az aklacinomicin A-ra 46 mikrogramm/ml, az aklacinomicin B-re 23 mikrogramm/ml. Az aklacinomicin izolálása céljából úgy járunk el, hogy az antibiotikumot vagy a micélium kiszűrése nélkül a teljes tenyészléből, vagy az előzőleg szűréssel elválasztott micéliumról és a tenyészléből különkülön egy alkalmas oldószerrel extraháljuk. Az antibiotikumok legnagyobb része a diatómafölddel kevert micéliumból álló kiszűrt anyagon található. Szűrés után a kiszűrt anyagot az antibiotikumok leoldása céljából egy szerves oldószerrel pépesítjük, majd keverjük. Ilyen alkalmas oldószerek az alkoholok, például metanol, etanol, butanol, a ketonok, mint például aceton, metiletil-keton, a halogénezett szénhidrogének, mint például kloroform, metilén-klorid, a szerves vagy szervetlen savak, mint például ecetsav, sósav, kénsav benzolos vagy vizes oldatai. Előnyösen acetont, etil-acetátot, szerves oldószerek keverékeit, mint például alkoholokat és vízzel nem elegyedő ketonokat, és szervetlen vagy szerves savak vizes oldatait alkalmazzuk. A szűrletben levő antibiotikumok extrakciójánál előnyösen úgy járunk el, hogy a gyengén megsavanyított vagy semlegesített szűrlethez kétszeres térfogatú vízzel nem elegyedő szerves oldószert, például butanolt, kloroformot, etil-acetátot, butil-acetátot vagy benzolt adunk. Az aklacinomicin kinyerési módszerei közül a szilikagélt, alumínium-oxidot, Sephadex LH20-at (Pharmacia Fine Chemicals AB, Uppsala, Sweden), vagy szintetikus adszorbenseket alkalmazó ellenáramú megosztásos kromatográfia, az aktívszénen és más hasonlókon történő adszorpció, valamint az oldószeres extrakcióknak ezen módszerekkel való kombinálása a leghatékonyabb. A tenyészléből a micélium elválasztása nélkül, a fent említett módszerekkel közvetlenül extrahálhatjuk az antibiotikumokat. Csökkentett nyomáson végzett betöményítés után a szűrlet pH-ját 5 és 7 közé állítjuk be, és egy vízzel nem elegyedő oldószerrel, például n-butanolial, amil-alkohollal, etil-acetáttal, kloroformmal, benzollal, metilén-kloriddal, metil-propil-ketonnal, vagy más hasonlóval ismételten kirázzuk. A vízzel nem elegyedő szerves oldószeres oldatból a nyers aktív anyagot sárga por formájában csökkentett nyomáson végzett betöményítéssel és kevéssé poláros oldószerekkel, például telített szénhidrogénekkel, mint amilyen például az n-hexán, ciklohexán, petroléter, vagy éterekkel, mint amilyen például a dietil-éter és a dipropil-éter, végzett kicsapással nyerjük ki. Az egyéb színanyagoknak, például a cinerubin A-nak és B-nek a nyers aktív anyagból való eltávolítása és tiszta aklacinomicin A és B előállítása céljából úgy járunk el, különböző adszorbenseken, például szilikagélen, alumímum-oxidon, Sephadex LH—20-on végzett oszlopkromatográfia, gyengén savanyú gyantákon és polisztirol-divinil-bénzol alapú keresztkötésű mátrix gyantákon, Például Amberhte XAD-n végzett ioncsere, különböző fémekkel, mint például kupri-, ferro-, ferri-, kalcium- és magnézium-ionokkal végzett kelátképzés, valamint a fémionokkal végzett kelátképzés, az oldószeres kicsapás, az oldószeres extrakció, az ellenáramú megosztás stb. kombinációja útján további tisztítást végzünk. Például a nyers aklacinomicin A-t és B-t kismennyiségű kloroformban oldjuk, szilikagéllel töltött oszlopra visszük fel, és kloroform-metanol eleggyel eluáljuk. Először egy kloroform-metanol 50 : 1 arányú eleggyel az aklacinomicin B-t eluáljuk az oszlopról, majd a fenti oldószerek 30: 1—20: 1 arányú elegyével az aklacinomicin A-t. Az aklacinomicin A-t és B-t tartalmazó eluátumokat csökkentett nyomáson, külön-külön betöményítjük, majd a cinerubin A-tól és B-től, valamint egy kismennyiségű színanyagtól szintetikus adszorbensen, Column Lite-on (AL203.Mg0.2 Si02.4H20, Fuji Chemical Co.), Floridil-en (aktivált magnézium-szilikát, Florodon Co.), vagy hidroxi-apatiton végzett oszlopkromatográfiával, vagy a cinerubin A és B kelát-komplexben való megkötése céljából 1 X 10 3—1 X 10 2 mólnyi mennyiségű, CuC04, FeCl3, FeS04 vagy MgS04 hozzáadásával, majd ezt követő Sephadex LH20-on végzett oszlopkromatográfiával tisztítjuk meg teljesen. A tiszta aklacinomicin A és B ily módon nyert tiszta oldatait csökkentett nyomáson szárazra párolhatjuk, vagy liofilizálhatjuk önmagában vagy szérum albuminnal, globulinnal, zselatinnal, glicerinnel, cukrokkal, aminosavakkal, szervetlen vagy szerves savakkal stb. együtt. A fent említett módszerek kombinációja útján nyert, és az alábbi példákban leírt aklacinomicin A és B a különböző oldószer-rendszerek alkalmazásával végzett vékonyréteg-kromatográfiás vizsgálatokban jelentkező egyetlen foltjuk, állandó olvadáspontjuk és jobbraforgatásuk, elemi analízisük, az ultraibolya, látható, NMR és infravörös abszorpciós spektrumukban megtalálható jellemző csúcsaik tanúsága szerint tiszta és egységes anyagok, és a következő tulajdonságaik vannak: Aklacinomicin A: Gyengén bázikus kémhatású, lipofil por vagy mikrokristályos por. Az elemi analízis a következő értékeket adja: C42H54N015 összegképletre: számított: C 62,05%, H 6,69%, O 29,52%, N 1,72%, mért: C 62,37%, H 6,67%, O 29,38%, N 1,82%. Molekulasúly: 813. Olvadáspontja 129—135 C°, 1 mólos kloroformos oldatának jobbraforgatása [a]“ = + 29°. Az ultraibolya és a látható fény tartományában felvett abszorpciós spektruma (1. ábra) a következő hullámhosszértékeknél mutat maximumokat: metanolban : 229,5 nm, E}% cm 540 258 nm, E{% cm 301 290 nm, Ej% cm 128 434 nm, E|% cm 147 0,1 normál 229,5 nm, E}% cm 578 sósav-metanolban 258 nm, E}% cm 329 290 nm. Ej% cm 141 434 nm, Ej% cm 164 0,1 normál 239,5 nm, Ej% cm 678 nátrium-hidroxid-288 nm, E}% cm 232-metanolban 314 nm, E{% cm 156 523 nm, E[% cm 170 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 7
