172209. lajstromszámú szabadalom • Eljárás az antraciklin-glikozidjellegű aklacinomicin a és b tumorellenes antibiotikum előállítására
21 172209 22 1. példa A következő összetételű vizes táptalajt készítjük el: Százalék Burgonyakeményítő 1 Glükóz 1 „Prorich” 1,5 kh2po4 0,1 k2hpo4 0,1 MgS04.7 H20 0,1 NaCl 0,3 Ásványi sók* 0,125 szilikon (KM75) 0,05 pH 7,0 * Ásványi sók : 2,8 g CuS04.5 H20,0,4 g FeS04.7 H20, 3,2 g MnCl2.4 H20, 0,8 gZnS04.7 H20 500 ml vízben. E táptalaj 100 ml-nyi mennyiségét egy 500 ml-es Sakaguchi-rázólombikban 15 percen át 120 C°-on sterilizálunk, majd egy platinakacs segítségével beoltjuk a Streptomyces galilaeus MA144—Ml (ATCC 31133) ferdeagar-tenyészetével. 48 órán át 28 C°-on inkubáljuk rázóasztalon. Egy 20 literes, rozsdamentes acélból készült fermentorban levő 10 liter, előzőleg sterilizált táptalajt a fenti tenyészet 20 ml-ével aszeptikus körülmények között átoltunk. A tenyésztést keverés (240 fordulat/perc) és levegőztetés (5 liter/perc) közben 28 C°-on 32 órán át végezzük. Az így nyert tenyészlé hatóanyagtartalom: 37 mg/ml aklanomicin A és 21 mg/ml aklanomicin B) pH-ját 4,5-re állítjuk, diatómaföld adszorbenst keverünk bele, majd a micéliumot kiszűrjük. Az így nyert szűrletet és a kiszűrt anyagot külön-külön extraháljuk. Acetonban (3 liter/kg nuccsnedves anyag) szuszpendáljuk a kiszűrt anyagot, 2 órán át kevertetjük, leszűrjük, és a kiszűrt anyagot még egyszer extraháljuk acetonnal. Az így nyert extrák tumokat csökkentett nyomáson eredeti térfogatuk egytizedére bepároljuk. A nyert olajos anyagból 20 g-ot 20 g szilikagéllel (Mallinckrodt Chem. Co.) elkeverünk, egy szilikagéllel töltött, 40 cm hosszú és 4,5 cm átmérőjű oszlopra viszszük fel, majd egy benzol-aceton-metanol eleggyel eluáljuk. Az 1: 1: 0 arányú eleggyel eluált kezdeti eluátumot kidobjuk, és az 1: 3 : 0 és 1: 3 : 0,3 arányú elegyekkel eluált aktív frakciókat csökkentett nyomáson szárazra pároljuk. E nyers anyag 11,5 g-nyi mennyiségét kevés etil-acetátban oldjuk, és a fentivel azonos szilikagél oszlopra visszük fel. A benzol-aceton 1: 1 és 2: 1 arányú elegyekkel nyert kezdeti eluátumokat kidobjuk, majd először ugyanezen oldószerek 1: 3 és 1:5 arányú elegyével az aklacinomicin B frakciókat, majd benzol-aceton-metanol 1: 5 : 0,5 és 1:5:1 arányú elegyekkel az aklacinomicin A franciókat eluáljuk az oszlopról. Az eluátumokat vízmentes nátrium-szulfáton szárítjuk, majd csökkentett nyomáson szárazra pároljuk. Sárga színű por formájában 4,8 g nyers terméket (hatóanyagtartalom 283 mg aklacinomicin A) és 3,5 g nyers, 130 mg aklacinomicin B-t tartalmazó terméket nyerünk. 2. példa Az 1. példa szerint előállított 2,0 g nyers aklacinomicin B-t 3 g szilikagéllel keverünk, egy 25 g szilikagéllel töltött, 15 cm hosszú és 2 cm átmérőjű oszlopra visszük fel, az aklacinomicin B frakciót 1% metanolt tartalmazó kloroformmal eluáljuk, majd az eluátumot csökkentett nyomáson kis térfogatig betöményítjük. A tömény oldathoz kevés n-hexánt adva, sárga por formájában 40 mg 90% tisztaságú aklacinomicin B-t nyerünk. 3. példa Az 1. példa szerint előállított 2,0 g nyers aklacinomicin A-t kevés kloroformban oldunk, egy 30 g szilikagéllel töltött, 20 cm hosszú és 2,0 cm átmérőjű oszlopra visszük fel. Az aglikont, aklacinomicin B-t és egyéb szennyezéseket tartalmazó színanyagokat először kloroformmal és 1,5% metanolt tartalmazó kloroformmal eluáljuk, majd 2% metanolt tartalmazó kloroformmal az aklacinomicin A frakciókat eluáljuk, végül az eluátumot csökkentett nyomáson szárazra pároljuk. 53 mg aklacinomicin A-t nyerünk sárgaszínű porként. 4. példa Az 1. és 3. példa szerint előállított nyers aklacinomicin A vagy B még tartalmaz kevés, az 1. példa szerint tenyésztett tenyészlében keletkezett cinerubin A-t vagy B-t, a cinerubin A és B szennyezést különböző fémionokkal történő kelátképzés útján el lehet távolítani. A 3. példa szerint előállított nyers, poralakú aklacinomicin A-t 20 ml kloroformban oldjuk, és 20 ml 1%-os CuS04 oldatot adunk hozzá. Erélyesen összerázzuk az oldatokat, 1 órán át állni hagyjuk, a vizes fázistól elválasztott kloroformos fázishoz 10 3 mólos EDTA (etiléndiamin-tetraecetsav) oldatot adunk, 1 percig erélyesen rázogatjuk az elegyet, utána a kloroformos fázist elválasztjuk, majd vízzel kétszer kirázva mossuk. A kloroformos extraktumot vízmentes nátrium-szulfáton szárítjuk, és csökkentett nyomáson betöményítjük. Kevés n-hexán hozzáadására 120 mg tiszta aklacinomicin A csapódik ki. 5. példa Az 1. példa szerint előállított 300 mg nyers aklacinomicin B-t 10 ml metil-celloszolvban oldunk, és 1 ml 100 mg/ml koncentrációjú CuS04 oldatot adunk hozzá. Az elegyet egy éjszakán át állni hagyjuk, másnap a kivált kismennyiségű csapadékot kicentrifugáljuk, a felülúszó oldatot csökkentett nyomáson eredeti térfogatának felére töményítjük, majd egy Sephadex LH20-szal töltött, 100 cm hosszú és 4 cm átmérőjű oszlopon, metanollal kromatografáljuk. A kezdetben lejövő szennyezéseket és a bíborbahajló színű cinerubin B-Cu komplexet elvetjük, az ezután kapott sárga frakciókat összegyűjtjük, 10~3 mólos EDTA oldathoz adjuk, és csökkentett nyomáson eredeti térfogatának egyharmadára töményítjük. A sűrítményből az aklanomicin B-t kloroformmal extraháljuk, majd az extraktumot csökkentett nyomáson szárazra pároljuk. 128 mg tiszta aklacinomicin B-t nyerünk. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 11
