172209. lajstromszámú szabadalom • Eljárás az antraciklin-glikozidjellegű aklacinomicin a és b tumorellenes antibiotikum előállítására
23 172209 24 A következő összetételű vizes táptalajt készítjük el: Százalék 6. példa Burgonyakeményítő 2 Glükóz 2 „Meat” 2,5 kh2po4 0,1 K2HP04 0,1 MgS04.7H20 0,1 NaCl 0,3 MnCl2.4H20 0,0005 FeS04.7 H20 0,0005 szilikon 0,05 pH 7,2 E táptalaj 50 ml-nyi mennyiségét egy 500 ml-es Erlenmeyer-lombikban 15 percen át 120 C°-on sterilizáljuk, majd a Streptomyces galilaeus MA144—Ml megfagyasztott tenyészlevének 1 ml-ével beoltjuk. 48 órán át 30 C°-on inkubáljuk egy körkörös rázóasztalon. E tenyészet 200 ml-nyi mennyiségével aszeptikus körülmények között beoltunk egy 20 literes, rozsdamentes acélból készült fermentorban levő 10 liter fent leírt táptalajt. Keverés (300 fordulat/perc) és levegőztetés (5 liter/perc) közben 18 órán át 30 C°-on inkubáljuk, majd e tenyészet 10 liternyi mennyiségét egy 1000 literes rozsdamentes fermentorban levő 600 liter fent leírt összetételű sterilizált táptalajhoz adjuk, és levegőztetés (200 liter/perc) és keverés (180 fordulat/perc) közben 48 órán át 30 C°-on inkubáljuk. Az így nyert tenyészlé (hatóanyagtartalom : 45 mcg/ml aklacinomicin A) (570 liter) pH-ját 250 ml 30%-os kénsav hozzáadásával 5,0-re állítjuk, az elegyet diatómaföld adszorbenssel elkeverjük, szűrjük, az így kapott 53,5 kg súlyú kiszűrt anyagot 70 liter acetonban szuszpendáljuk, 3 órán át keverjük, majd szűrjük. A kiszűrt anyagot 85 liter acetonban még egyszer extraháljuk. Az extraktumokat csökkentett nyomáson 40 liter térfogatra betöményítjük, és 25 liter etil-acetáthoz adjuk. Az etil-acetátos fázist elválasztjuk, és csökkentett nyomáson 1 liter térfogatra betöményítjük. A nyers aklacinomicin keveréket ebből a sűrítményből 1 liter n-hexán hozzáadásával csapjuk ki, ezt leszűrjük, n-hexán-etil-acetát 50: 1 arányú elegyével kétszer mossuk, így 15,5 g narancssárga port nyerünk. Ezt a nyers port 200 ml etil-acetátban oldjuk, és egy 700 g Column-Lite-al töltött, 35 cm hosszú és 7 cm átmérőjű oszlopra visszük fel, majd etil-acetát-metanol-eleggyel (1: 1) eluáljuk. Az aklacinomicin A-t tartalmazó sárga színű frakciókat csökkentett nyomáson szárazra pároljuk. 12,4 g nyers aklacinomicin A-t 100 ml kloroformban oldunk, és 50 ml 0,01 mólos foszfát-pufferben (pH: 6,8) oldott 10 3 mólos EDTA-oldathoz adjuk. A maradék fémionok eltávolítására erélyesen rázogatjuk, a kloroformos fázist vízzel kétszer kirázva mossuk, vízmentes nátrium-szulfáton szárítjuk, és csökkentett nyomáson szárazra pároljuk. 11,1 g aklacinomicin A-t nyerünk sárga színű por formájában. A „Sephadex LH—20” lipofil, oldhatatlan, kromatográfiás célokra alkalmazható, kenesztkötéses dextránból álló molekulaszűrő, a Pharmacia (Uppsala, Svédország) hozza forgalomba. Az előző példákban használt Sephadex LH—20 helyett használatunk más hasonló gélszűrőket is, mint amilyen például a Sephadex G25— G200, Sepharose 4B és 6B (Pharmacia Fine Chemicals AB, Uppsala, Svédország) és Bio-Gel A 1,5 m (Bio Rad Co.). Az előnyösen alkalmazható gélszűrő anyagok közé tartoznak a 3 819 836 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás 3. és 4. oszlopában leírt, karboximetil-szubsztituált, keresztkötéses dextrán gélek. 7. példa 50 mg aklacinomicin A-t 0,01 mólos sósavoldatban oldunk, majd steril 0,01 mólos pH =6,0 értékű foszfátpufferrel 50 ml-re hígítjuk. 500 mg borjúcsecsemő mirigy DNA-t (magas polimerizációs fokú 5. típus, Sigma Co.) 50 ml fenti puíferoldatban oldunk, 15 percen át 120 C°-on autoklávozzuk, majd gyorsan lehűtjük. Az aklanomicin A oldatot ezután steril körülmények között a DNA oldathoz keverjük, majd steril fiziológiás sóoldattal szemben 24 órán át dializáljuk, majd liofilizáljuk. 8. példa 1 g aklacinomicin A-t és 100 mg borkősavat külön 500—500 ml etilacetátban oldunk, a két oldatot elegyítjük, majd a kapott oldatot vákuumban szárazra pároljuk. 9. példa 100 mg tisztított aklacinomicin A-t 50 ml desztillált vízben szuszpendálunk, majd 0,1 n sósav hozzáadásával fokozatosan feloldjuk. A sósav adagolását akkor fejezzük be, amikor az elegy pH-ja 5,0 értéket ér el. Az oldatot ezután PH jelű szűrőn (Millipore Co.) keresztül szűrve 2 ml-enként 15 ml-es ampullákba töltjük, majd az ampullákat liofilizáljuk és fagyasztva szárítjuk. Szabadalmi igénypontok 1. Eljárás az I általános képletű tumorellenes aklacinomicin antibiotikum-komplex, komponensei, az aklacinomicin A, aklacinomicin B — mely általános képletben R jelentése A vagy B képletű csoport —, továbbá ezek nem-toxikus savaddíciós sóinak és dezoxiribonukleinsav-komplexének előállítására, azzal jellemezve, hogy az aklacinomicint termelő Streptomyces galilaeus ATCC 31133 törzset asszimilálható szén- és nitrogénforrást tartalmazó táptalajon 25—30 C° hőmérsékleten 5 és 9 közötti pH-értéken süllyesztett, levegőztetett körülmények között tenyésztjük, majd a fermentlében jelenlevő komplex aklacinomicint elkülönítjük, ebből kívánt esetben izoláljuk az aklacinomicin A és/vagy B faktort, és az ily módon izolált aklacinomicin A és/vagy B faktort kívánt esetben valamely nem-toxikus savval vagy dezoxiribonukleinsavval reagáltatjuk. (Elsőbbsége: 1975. július 25.) 2. Az 1. igénypont szerinti eljárás foganatositási módja az I általános képletű tumorellenes aklacinomicin antibiotikum-komplex komponensei, az aklacinomicin A, aklacinomicin B — mely általános képletben R jelen-5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 12
