171719. lajstromszámú szabadalom • Eljárás új antibiotikum előállítáásra
5 171719 6 tartozó mikroorganizmusok tenyésztéséhez szokásos tápközeget felhasználhatunk. Szükséges, hogy a tápközeg egy vagy több asszimilálható szénforrást és nitrogénforrást, valamint ásványi sókat tartalmazzon. Ezek a komponensek mind definiált alkotórészként, mind öszszetett keverék, főleg biológiai eredetű termékek alakjában lehetnek jelen. Szénforrásként bármely szokásos szénforrás jöhet szóba, így például keményítő, melasz, savópor, dextrin, cukor (például szacharóz, maltóz, glükóz, laktóz, szorbit) és glicerin. Nitrogénforrásként bármely szokásos szerves vagy szervetlen nitrogénforrást alkalmazhatunk. Példaként az alábbiakat soroljuk fel: szójaliszt, gyapotmagliszt, lencseliszt, sárgaborsóliszt, oldható és oldhatatlan növényi proteinek, a kukorica áztató leve, élesztőkivonatok, peptonok, húskivonatok, valamint ammónium-sók és nitrátok, például ammóniumklorid, ammóniumszulfát, nátrium- és káliumnitrát. A tápközegben jelenlevő ásványi sók például az alábbi ionokat adják: Mg+ + , Na+, K+, Ca++, NH4+, Cl", S0 4 —, P0 4 , N0 3 ", valamint a szokásos nyomelemek, így réz, vas, mangán, molibdén, cink, kobalt és nikkel ionjait. Amennyiben a szén- és nitrogénforrások, illetve az alkalmazott víz ezeket a sókat és nyomelemeket nem tartalmazza kielégítő menynyiségben, a tápközeget célszerűen kiegészítjük. A táptalaj összetétele általában attól függ, milyen anyagok állnak különösen előnyösen rendelkezésre. A találmány szerinti eljárás foganatosításakor előnyösnek bizonyulhat, hogy az Actinoplanes-törzsek tenyésztésének elején az oldható tápanyagokat csak viszonylag kis koncentrációban alkalmazzuk, majd a tenyésztés első három napja alatt gyakori adagolással adjuk a tenyészethez az oldható tápanyagokat steril, viszonylag koncentrált oldatok alakjában. A növekvő tenyészetek pH értékét előnyösen 6,5 és 7,5 között tartjuk. Ha a pH érték a savas tartományba eltolódik, valamilyen szerves vagy szervetlen bázist, előnyösen kalcium karbonátot adagolunk. A pH értéket a fermentációs technológiában szokásos módon automatikusan is szabályozhatjuk steril szerves vagy szervetlen sav, például kénsav, vagy steril lúg, például nátriumhidroxid szakaszos injektálásával. A tenyésztés alatt célszerűen biztosítjuk, hogy a mikroorganizmusok kielégítő mértékben érintkezzenek az oxigénnel és a tápanyagokkal. Ez általánosan ismert módon, így rázassál vagy keveréssel történhet. A tenyésztés mintegy 20 és 40 °C közötti, előnyösen 25 és 35 °C közötti, különösen előnyösen mintegy 28 °C hőmérsékleten végezzük. A tenyésztés időtartama különböző lehet, például a tápközeg összetételétől és a tenyésztési hőmérséklettől függ. Az optimális feltételeket a mikrobiológiában járatos szakember könnyen állapíthatja meg. Kísérleteink során azt tapasztaltuk, hogy a tápközegben feldúsuló antibiotikum a 2—12., főleg 5—8. napon eléri a maximális koncentrációt. Mint mikrobiológiai eljárásoknál általában, a kultúraközeg idegen mikroorganizmusokkal való fertőzésének lehetőségét célszerűen kiküszöböljük. E célból a szokásos intézkedéseket tesszük, amilyen például a tápközeg sterilizálása, a használt edények és a levegőztetéshez használt levegő csíramentesítése. A sterilizálást gőzzel vagy száraz sterilizálásként végezhetjük. Ha a tenyésztés során nemkívánatos mennyiségű hab képződik, a szokásos habzás elleni anyagokat adagoljuk, így például folyékony zsírokat, olajokat, olaj—vízemulziókat, paraffinokat, hosszabb szénláncú alkoholokat, így oktadekanolt, szilikon-olajokat és polioxietilén-, illetve polioxipropilén-vegyületeket. A habzást mecha-5 nikai úton (például a centrifugális erő kihasználásával) fékezhetjük, illetve megszüntethetjük. A találmány szerinti antibiotikumot a micéliumból és/vagy a tenyészetből ismert fizikai-kémiai módszerekkel izolálhatjuk. Az elkülönítést például a szokásos 10 extrakciós, kicsapásos és/vagy kromatográfiai eljárások segítségével végezhetjük. Az antibiotikum további tisztítását (finomtisztítását) szintén az említett módszerek segítségével végezhetjük. Sok esetben azonban a finomtisztítás nem szükséges, mert az esetleg meglevő szeny-15 nyeződések az antibiotikum hatását nem rontják. Az elkülönítés és tisztítás során arra kell ügyelnünk, hogy a pH érték 7,0 felett, előnyösen 7,0 és 9,0 között legyen. A pH érték beállításához szervetlen és szerves bázisokat, például ammónium-hidroxidot, alkáli- és alkáliföldfém-20 hidroxidokat, alkáli- és alkáliföldfémkarbonátokat és -hidrogénkarbonátokat, így káliumhidroxidot, nátriumhidroxidot, nátriumkarbonátot, nátriumhidrogénkarbonátot, kalciumkarbonátot, trialkilaminokat, így trietilamint, morfolint és piridint alkalmazhatunk. Az elkü-25 lönítés, illetve tisztítás során azt a frakciót, amelyben a találmány szerinti antibiotikum a legmagasabb koncentrációban, illetve a legtisztábban van jelen, a szokásos fizikai-kémiai eljárások segítségével határozzuk meg, így például a 267 nm-nél fellépő sáv megmérésével, az 30 Rf értékek megmérésével, vagy előnyösen a mikróbaellenes aktivitás vizsgálatával. Az utóbbi esetben különösen előnyösen az Escherichia coli (például Escherichia coli ATCC 9637) elleni aktivitást vizsgáljuk meg a szokásos lemezpróbával (vö.: P. Klein, Bakteriologische Grund-35 lagen der chemotherapeutischen Laboratoriumspraxis, Springer kiadó, Göttingen [1957], 86. old.). Folyékony vizes tápközeg alkalmazása esetén a találmány szerinti antibiotikumot például az alábbiak szerint izolálhatjuk és tisztíthatjuk: a tenyészléhez valamilyen, 40 vízzel elegyedő oldószert adunk és az elegyet jól elkeverjük. Ezzel egyrészt a hatóanyagot extraháljuk a micéliumból, másrészt gyakran a tenyészlé is tisztul. Vízzel elegyedő oldószerként például rövidszénláncú alkilalkoholokat, így metanolt, etanolt, n- és i-propanolt vagy 45 terc-butanolt, továbbá dimetilformamidot, tetrahidrofuránt, különösen előnyösen acetont alkalmazhatunk. Az oldószer mennyiségét széles határokon belül változtathatjuk. Célszerűen a tenyészlére számítva azonos térfogatú oldószert adagolunk. Alapos keverés után az 50 oldhatatlan részeket (micéliumot, kicsapódott proteineket stb.) szűréssel, centrifugálással, ülepítéssel stb. elválasztjuk. A vizes-szerves oldatot célszerűen vákuumban például az alkalmazott tápközeg eredeti térfogatára bepároljuk. 55 Adott esetben bázissal, előnyösen nátriumhidroxiddal 7 feletti pH értéket, például 9-et állítunk be. Az így kapott oldatot a továbbiakban „I. oldat"-nak nevezzük. Az I. oldatból az antibiotikumot extrakcióval, kicsapással vagy kromatográfiás úton izoláljuk, majd adott 60 esetben tisztítjuk. Kromatográfiai módszerként az oszlopkromatográfiát vagy a preparatív vékonyréteg-kromatográfiát alkalmazzuk. Adszorbensként minden nemsavas szervetlen vagy szerves adszorbenst használhatunk, például alumíniumoxidot, kovasavgélt, magné-65 ziumszilikátot, aktívszenet, cellulózt, cellulóz-származé-3
