171383. lajstromszámú szabadalom • Eljárás immunogén anyagok elkülönítésére Pasteurella Haemolytica vagy Pasteurella multocida törzsekből és ezeket tartalmazó vakcina előállítására

19 171383 20 30 C°, majd végül 10 percig Ezután beindítjuk a pirolízist. A „Temperature" szabályozót 850C°-ra, az „Interval" kapcsolót 20 másodpercre, és a „Ramp" kapcsolót „OFF" állásba kapcsoljuk, és így a lehető leggyorsabb hőmérsékletemelkedést állítjuk be. Ezután pirolizált anyagot Perkin-Elmer 900 gázkromatográfiás készülékben (a Perkin-Elmer cég terméke) kromatografáljuk, a következő körülmények között: Detektor: F. I. D. Oszlop: 183 x 0,275 cm, saválló acél Stacioner fázis: O. V. 225 (cianopropilmetil-fenilmetil-szilikon, 5%) Hordozó: Phasesep Universal 85-100 B. S. mesh (nagymértékben szilánozott hordozóanyag, a Phase Separation Ltd. cég terméke) Hordozó gáz: nitrogén Bemeneti nyomás: 2,8 kg/cm2 Áramlási sebesség: 25 ml/perc az oszlop kimeneténél, szobahőmérsékleten Hőmérséklet-program: 2 percig 16C°/perc sebességgel 200C°-ig, 200 C° Injektor hőmérséklete: 140 C° Injektor állása: 5 Többszörös hőmérséklet: 230 C° Többszörös beállítás: 5 Levegő nyomása: 0,35 kg/cm2 Hidrogén nyomása: 1,54 kg/cm2 Csillapítás: 1 x 10- 16x10 Kiírás: kétcsatornás Smiths Servoscribe, (a Smith Industries Ltd. cég terméke) párhuzamosan kötött tollakkal. A zöld toll 5 mV-nál, a fekete toll 50 mV-nál éri el a teljes skála-kitérést. Regisztrálási sebesség: 600 mm/óra. Az immunogén anyagok pirolizált mintáinak gázkromatogramjait a 7-12. ábrákon mutatjuk be. Minden esetben az időskála akkor indul, amikor a mintát az injektor-részébe helyezzük. A 7. ábra az Al anyag kromatogramja (csillapítás: 16 x 10) A 8. ábra ugyancsak az Al anyag kromatogramja (csillapítás: 8x10, majd 8 perc múlva 16 x 10, a teljesítményt kétszeresre növeltük). A 9. ábra az El anyag kromatogramja (csillapítás: 1x10). A 10. ábra az (csillapítás: növeltük). A 11. (csillapítás: 1 x 10) A 12. ábra a 1 x 10. E2 anyag kromatogramja i teljesítményt kétszeresre 10 15 20 25 30 35 40 45 50 ábra a D anyag kromatogramja B2 anyag kromatogramja (csillapítás: 4x10, majd 6,8 perc múlva 1x10, az erősítést kétszeresre növeltük). 4. Mikroanalízis Az Al, Bl, D és El anyagok mikroanalízise során a következő vizsgálatokat végeztük el: 55 60 b) összes szénhidrát meghatározása anthrone-módszerrel [Whistler, Wolfrom és Launer: Methods in Carbohydrate Chemistry, I. kötet, 389, (1969) kiadó: Academic Press]. c) Cukormeghatározás: 2-4 mg anyagot 1 ml 0,2 n sósavoldatban oldatot üvegcsőbe töltjük, a csövet 30 percig 100C°-on tartjuk. A kapott tumot vákuumban szárítjuk, 0,1 ml immunogén oldunk, az lezárjuk, és hidrolizádesztillált vízben oldjuk, és Whatman No. 4 szűrőpapíron kromatograf áljuk. Futtató szerként 25 : 6 : 25 arányú butanol-ecetsav-víz egyensúlyi elegy felső fázisát használjuk. A kromatogramok kifejlesztése után az egyes kromatogramokat a következő reagensekkel permetezzük be [v.o. „Data for Biochemical Research", kiadó: R. M. C. Dawson és társai, Oxford, (1959)]: (i) anilin-ftalát (aldóz-cukrok meghatározására), érzékenység: 2 mg, glükózra vonatkoztatva (lásd az idézett szakkönyv 238. oldalát), (ii) naftorezorcin (keton-cukrok és pentózok meghatározására), érzékenység: 10 mg, fruktózra vonatkoztatva (lásd az idézett szakkönyv 239. oldalát), (iíi) difenilamin lásd az idézett felhasznált reagens anilin-oldatból és difenilamin-oldatból felhasználás előtt 10 ml forsav-oldatot adunk. (iv) acetilaceton - p-dimetilamino-benzaldehid (hexózaminok és N-acetil-hexózaminok meghatározására, lásd az idézett szakkönyv 243. oldalát). A mikroelemzés eredményeit a 3. táblázatban közöljük. 3. táblázat (aldóz-cukrok meghatározására, szakkönyv 239. oldalát). A 50 ml 2 vegyes%-os acetonos 50 ml 2 vegyes%-os acetonos áll. Az elegyhez közvetlenül 88 vegyes%-os vizes fosza) Összes nitrogén meghatározása mikro-Kjeldahl módszerrel [Williams és Chase. Methods in Immunology and Immunochemistry, II. kötet, 257 (1968) kiadó: Academic Press]. 65 Al Bl D El Összes nitrogén, % n.a. 5,5 n.a. 4J összes szénhidrát, % 46,3 9,76 13,5 10,2 Cukrok (i) áldozok + nyomok + nyomok (ii) pentózok és keton-cukrok -nyomok — nyomok (iii) áldozok -nyomok + nyomok (iv) hexózok és N-acetil-hexózaminok — — — Megjegyzés: + = pozitív reakció, -negatív reakció, n.a. = nincs adat 10