171383. lajstromszámú szabadalom • Eljárás immunogén anyagok elkülönítésére Pasteurella Haemolytica vagy Pasteurella multocida törzsekből és ezeket tartalmazó vakcina előállítására

17 171383 18 gyártmánya) gélkromatográfiának vetjük alá (v.o. Williams és Chase „Methods in Immunology and Immunochemistry" I. kötet, 135. oldal (1968) kiadó: Academic Press]. A géldiffúzió alapján immunogén anyagokát tartalmazó frakciókat egyesítjük, desztillált vízzel szemben dializáljuk, majd 7 további kísérletben nyert dializátummal egyesítjük, és az elegyet fagyasztva szárítjuk. Bl jelű immunogén anyagot kapunk. 10. példa E típusú tokos P„ multocida sejtekből elkülönített immunogén anyag tisztítása A 3. példában kapott anyag két részletét külön-külön tisztítjuk. A tisztítást a 6. példában leírt módon végezzük, azzal a különbséggel, hogy az 1. példa szerint kapott anyag helyett a 3. példa szerint kapott anyagból indulunk ki. Két tisztított immunogén anyagot kapunk, amelyet a továbbiakban El-gyel, illetve E2-vel jelölünk. Ekét termék fizikai-kémiai jellemzői lényegében megegyeznek egymással, az eltérések - amelyek jelentéktelenek - feltehetően annak tulajdoníthatók, hogy az egyik anyagminta a másiknál több maradék szennyezést tartalmaz. 11. példa Az előző példák szerint kapott immunogén anyagok további vizsgálata, és a vizsgálatok eredményei A következőkben a 6. és 9. példa szerint előállított immunogén anyagokat B2-vel, illetve Bl-gyel, míg a 7. példa szerint, A és D típusú P. multocida sejtektől kapott immunogén anyagokat Al-gyel, illetve D-vel jelöljük. 1. Infravörös spektrum 1,5 mg Al, D, Bl, El, B2, illetve E2 jelű immunogén anyagot 16 mm átmérőjű káliumhalogenid-pasztillába préselünk, és felvesszük az anyagok infravörös spektrumát. Az Al, D, Bl, El, B2 és E2 jelű anyagok infravörös spektrumait az 1., 2., 3., 4., 5., illetve 6. ábrán tüntetjük fel. 2. Aminosav-elemzés Az Al, D, B2 és E2 jelű immunogén anyagok ismert súlyú (körülbelül 5 mg) mintáit 1 ml 6 n sósavoldatban 24 órán át 110C°-on hidrolizáljuk. Ezután a víz és a sósav nyomait bepárlással eltávolítjuk, és a maradékot pH = 2,2 értékű pufferoldattal 1 ml térfogatra egészítjük ki. Az így kapott pufferolt oldatok 0,2 ml-es részleteit Beckmann típusú aminosavelemző készülékben elemezzük. Az eredményeket a 2. táblázatban közöljük. 2. táblázat Aminosav Al D B2 E2 5 Triptofán 6,42 14,27 16,90 Lizin 11,94 27,51 54,40 34,11 10 Hisztidin 2,93 8,10 8,48 6,91 Arginin 23,72 54,21 19,59 17,73 15 Aszparaginsav 18,72 40,07 59,93 39,41 Treonin 5,74 12,32 16,46 11,25 Szerin 10,13 23,21 20,01 12,61 20 Glutaminsav 34,01 74,19 110,24 75,40 Prolin 38,72 85,07 25,14 15,63 ?s Glicin 70,78 165,85 31,28 19,75 zo Alanin 26,04 53,10 25,35 19,66 Valin 7,49 16,70 19,23 13,67 30 Metionin 3,28 7,23 8,96 6,97 Izoleucin 4,12 9,78 15,24 11,27 35 Leucin 9,48 20,17 32,04 23,65 35 Tirozin 3,04 7,58 13,64 8,66 Fenilalanin 6,58 13,70 14,90 9,99 40 Összes aminosav /zg/ immunogén anyag, mg 282,6 635,6 473,9 347,65 45 3. Pirolízis és gázkromatográfia Ma már jól ismert, hogy teljesen komplex biológiai anyagok is meghatározhatók pontosan szabályozott pirolízis és azt követő gázkromatog-50 ráfías analízis segítségével. Reiner és munkatársai [Chromatographia 5, 525 (1972)] normál és patológiás sejtek pirolízis-adatait közölték. Myers és munkatársai [Chromatographia 5, 321 (1972)] kimutatták, hogy a fehérjék, lipoidok és szénhid-55 rátok az anyag eredetére jellemző pirogrammokat adnak. Az immunogén anyag mintáit vízzel elegyítjük (100A/1 vízhez l-l mg Al, D, B2, Bl, El, illetve E2 jelű anyagot adunk). Az elegyeket ezután 50 mintatartályba helyezzük, és a tartályt a Pyroprobe 19Q{Chemical Date Systems Inc.) injektáló részébe tesszük. A mintát a víz és az illékony anyagok eltávolítása érdekében a pirolízis és a hőmérséklet-program beindítása előtt 6 percig ebben a 65 helyzetben tartjuk. 9