171383. lajstromszámú szabadalom • Eljárás immunogén anyagok elkülönítésére Pasteurella Haemolytica vagy Pasteurella multocida törzsekből és ezeket tartalmazó vakcina előállítására
15 171383 16 eltávolítása érdekében az oldatot desztillált vízzel szemben dializáljuk. \A dializátumhoz pelyhes csapadék kiválásáig 1 vegyes%-os vizes cetilpiridinium-klorid-oldatot adunk (25 C°-on 0,11 ml oldatra van szükség). A csapadékot centrifugálással 5 elkülönítjük, desztillált vízzel kétszer mossuk, majd 10 ml 3 mólos vizes nátriumklorid-oldatban oldjuk. A kapott oldatot 4C°-ra hűtjük. A kikristályosodott cetil-piridinium-kloridot 4 C°-on kiszűrjük, majd a kapott szűrlethez 90 ml metanolt adunk, és 10 az elegyet éjszakán át 4C°-on állni hagyjuk. A csapadékot centrifugálással elkülönítjük, desztillált vízben oldjuk, és az oldatot fagyasz'va szárítjuk. Az immunogén anyag nátriumsójából álló csapadékot kapunk. A kapott immunogén anyagot 15 B2-vel jelöljük. 7. példa Immunogén anyag elkülönítése A és D típusú P. múltoddá tenyésztési közegéből A kétféle immunogén anyagot azonos módszer- 25 rel különítjük el a megfelelő, azonos körülmények között tenyésztett tokos mikroorganizmusok tenyésztési közegeiből. Az A típusú mikroorganizmus letéti száma a Weybridge-intézetben 229, a Wellcome Research Laboratories intézetben 30 WCC—4022, míg a D típusú mikroorganizmus letéti száma az utóbbi intézetben WCC-5837. A fényvisszaverő sejteket frissen készített dextróz-keményítő-agar táptalajon (Difco) lapos 35 üvegben éjszakán át 37 C°-on inkubáljuk. A kifejlődött sejteket 0,1 mólos trisz-acetát-pufferoldattal pufferolt 2,5 vegyes%-os vizes nátriumklorid-oldattal (pH = 8,0) lemossuk, 300 ml agárhoz 10 ml oldatot használunk fel. A kapott sejtszusz- 40 penziót 10 percig 56 C°-on tartjuk, majd a sejteket 10 000 g gyorsuláson 30 percig végzett centrifugálással elkülönítjük. (Erre a műveletre nincs szükség, ha a sejtek az első oldószer beadásakor kicsapódnak.) A felső folyadékfázishoz 42 térf.% koncent- 45 ráció eléréséig metanolt adunk, az elegyet 10 percig szobahőmérsékleten állni hagyjuk, majd a csapadékot 10 percig 5000 g gyorsuláson centrifugálva elkülönítjük. A folyadékfázishoz ezután 48 térf.%, koncent- 50 ráció eléréséig metanolt adunk, és a csapadékot a fenti módcn elkülönítjük. A kapott terméket szárítjuk, 15 ml kezdeti felső folyadékfázisból 19 mg anyagot különítünk el. 55 Az A és D típusú sejtekből elkülönített immunogén anyagot sajátságai: 1. Általános jellemzők: 60 Mindkét anyag desztillált vízben legalább 20 mg/ml koncentrációban oldódó fehér por. A termékek 100C°-os vízzel 10 percig kezelve megtartják antigén sajátságaikat, és nem dializáihatók. 65 2. Toxicitás A termékek LDS0 -értékét csirke-embrión, pirogén hatását nyúlon határoztuk meg. A meghatározásokat az 1. példában leírt módon végeztük. Az alábbi eredményeket kaptuk: Típus LD50 Pirogén dózis (csirke-embrió) nyúlon A 5 Mg 5 Aíg D 5 Mg 5 Mg Az A és D típusú sejtekből elkülönített immunogén anyagok Milner-Finkelstein módszer szerint [J.Inf. Dis. 116, 529 (1966)], 5 Mg dózisban meghatározott pirogén indexe 20-nál kisebb. 3. Antigén hatás - immunogén hatás Mindkét szérumtípus teljes tokos sejtjeivel szarvasmarhákat oltunk be, majd a vérszérumokat a megfelelő nem-tokos sejtekkel adszorbeáljuk. A nem-adszorbeált szérum és az adszorbeált szérum egereken egyaránt védőhatást fejt ki a megfelelő tokos teljes élő mikroorganizmusokkal kiváltott fertőzésekkel szemben. A két termék immunogén hatását szarvasmarhán vizsgáljuk. A vizsgálatot az 1. példában leírt módon végezzük, azzal a különbséggel, hogy 3-3 borjúnak 6-6 mg immunogén anyagot adunk be. A kapott szérumok egéren védőhatást fejtenek ki a megfelelő mikroorganizmusokkal szemben. Az A típusú sejtekből elkülönített immunogén anyagot A1-gyei, a D típusú sejtekből elkülönített immunogén anyagot D-vel jelöljük. 8. példa Immunogén anyag elkülönítése A és D típusú tokos P. multocida sejtekből A 7. példában ismertetett mikroorganizmusokat az 1. példában megadott módon folyékony táptalajon tenyésztjük, a növekedési szakasz után a táptalaj pH-ját 8-ra állítjuk, majd a tenyészetet 10 percig 56C°-on tartjuk. A kivonást a 7. példában leírt módon végezzük. Al, illetve Djelű immunogén anyagot kapunk. 9. példa B típusú tokos P. multocida sejtekből elkülönített immunogén anyag tisztítása 5 mg, a 6. példában kapott, B2 jelű immunogén anyagot 1 mólos vizes nátriumklorid-oldatban oldunk, és az oldatot Biogel A5 agaróz-oszlopon (a Bio-Rad Laboratories, Richmond, California cég 8
