171339. lajstromszámú szabadalom • Eljárás B12-vitamin tartalmú fermentlevek feltárására és sejtmentesítésére
13 171339 14 cianid oldatot (0,2 g NaCN) adunk hozzá, majd az elegy pH-értékét 20%-os nátriumhidroxid oldattal (kb. 5 ml) 9 ± 0,2-re állítjuk be. Az elegyet állandó keverés közben vízfürdőn 70 C°-ra melegítjük és 30 percig ezen a hőmérsékleten keverjük. Ezután 100 ml 30%-os vas (lll)-klorid oldatot (35 g FeCl3 .6H 2 0) adunk hozzá, és 10 percig keverjük, majd 20%-os nátriumhidroxid oldattal (kb. 70 ml) az elegy pH-értékét 8 ± 0,2-re állítjuk be. További 10 perces keverés után a reakcióelegyet zsugorított üvegszűrőn szűrjük, majd jól leszívatjuk, kevés vízzel mossuk. A szüredék B^-vitamin-tartalma 20 500 gamma. Kitermelés: 96,3%. 4. példa 1500 ml-es lombikba 1000 ml 35 700 gamma BJ2 -vitamint tartalmazó, az 1. példában megadott fermentlevet mérünk be, majd szobahőmérsékleten 20 ml 1%-os nátriumcianid oldatot (0,2 g NaCN) adunk hozzá és az elegy pH-értékét 20%-os kalciumhidroxid oldattal (kb. 10 ml) 9 ± 0,2-re állítjuk be. Az elegyet állandó keverés közben vízfürdőn 70 C°-ra melegítjük és 30 percig ezen a hőmérsékleten keverjük. Ezután 100 ml 30%-os vas(III)-klorid oldatot (35 g FeCl3 .6H 2 0) adunk hozzá, majd 10 percig tovább keverjük. Ezután 20%-os klaciumhidroxid oldattal (kb. 70 ml) az elegy pH-értékét 8 ± 0,2-re állítjuk be. További 10 perces keverés után a reakcióelegyet zsugorított üvegszűrőn szűrjük, jól leszívatjuk, majd kevés vízzel mossuk. A szüredék B12 -vitamin-tartalma 35 270 gamma. Kitermelés: 98,9%. 5. példa 200 ml, 37 500 gamma/l B12 -vitamin tartalmú, az 1. példában megadott fermentléhez keverés közben 4 ml 1%-os nátriumcianid oldatot és annyi 20%-os nátriumhidroxidot adunk, hogy a fermentlé pH-értéke 9,02 legyen, majd 50 C°-ra melegítjük és 4 órán át ezen a hőmérsékleten tartjuk. Ezután 40,0 ml 30%-os vas(Ill)-klorid oldatot csepegtetünk hozzá, 10 percig keverjük, majd 26 ml 20%-os nátriumhidroxid oldattal az elegy pH-értékét 7,8-ra állítjuk be. További 10 percig keverjük a rendszert, majd leszűrjük, jól leszívatjuk, kevés vízzel mossuk. A szüredék B12 -vitamin tartalma 36375 gamma/l. Kitermelés: 97,1%. 6. példa 1500 ml-es lombikba 1000 ml 10 500 gamma B12 -vitamint tartalmazó, az 1. példában megadott fermentlevet mérünk be és szobahőmérsékleten 20%-os nátriumhidroxid oldattal a fermentlé pH-értékét 9 ± 0,2-re állítjuk be. Ezt követően az elegyhez 2,2 ml (0,175 g) 10% acetonciánhidrint tartalmazó acetonos oldatot adunk. Az elegyet állandó keverés közben vízfürdőn 70 C°-ra melegítjük és ezen a hőmérsékleten 30 percig keverjük. Ezután 50 ml 30%-os vas(III)-klorid oldatot (17,4 g FeCl3 . 6H 2 0) adunk hozzá, 10 percig keverjük, majd 20%-os nátriumhidroxid oldattal (kb. 35 ml) az elegy pH-értékét 8 ± 0,2-re állítjuk be. További 10 percnyi keverés után a reakcióelegyet zsugorított üvegszűrőn szűrjük, szárazra szívatjuk, majd kevés vízzel mossuk. A szüredék B12 -vitamin-tartalma 10 060 gamma Kitermelés: 95,8%. 7. példa Mindenben a 6. példa szerint járunk el, azzal a vál-10 toztatással, hogy 35 700 gamma B12 -vitamint tartalmazó, az 1. példában megadott fermentlevet dolgozunk fel és a vas(IIi)-klorid mennyiségét hatszorosára növeljük. A szüredék Bí2 -vitamin-tartalma 35 450 gamma. Kitermelés: 99,3%. 8. példa Mindenben a 7. példa szerint járunk el, azzal a vál-20 toztatással, hogy az 1. példában megadott fermentléhez 2,2 ml (0,175 g) 10% acetonciánhidrín gyengén lúgos vizes oldatát és 20 ml 1%-os káliumcianid oldatot adunk. Kitermelés: 98,7%. 9. példa 200 ml, 74 950 gamma/l Bj 2-vitamint tartalmazó, 30 az 1. példában megadott, szeparálással dúsított fermentléhez keverés közben8,0ml 1%-os nátriumcianid oldatot és annyi 20%-os nátriumhidroxid oldatot csepegtetünk, hogy a fermentlé pH-értéke 9,0 legyen, majd 70 C°-ra melegítjük és 30 percig ezen a hőfokon tartjuk. Ezután 35 50 ml 30%-os vas(III)-klorid oldatot (FeCl3.6H 2 0) csepegtetünk hozzá, 10 percig keverjük, majd 20%-os nátriumhidroxid oldattal az elegy pH-értékét 8,0-ra állítjuk be. További 10 percnyi keverés után a reakcióelegyet zsugorított üvegszűrőn szűrjük, jól leszívatjuk, 40 majd kevés vízzel mossuk. A szüredék Bj2 -vitamin tartalma 64 460 gamma/l B12 -vitamin. Kitermelés: 86,0%. A kiszűrt sejteket a fenti módszerrel másodszor fel-45 tárva további 8245 gamma/l B12 -vitamin nyerhető ki, amely 11%-nak felel meg, ily módon az összkitermelés: 97,0%. 50 10. példa 1 1 95 500 gamma/l B12 -vitamirit tartalmazó, az Országos Közegészségügyi Intézetben 24/63 szám alatt deponált Propionibacterium shermanii tenyészet fer-55 mentievéhez 40 ml 1%-os nátriumcianid oldatot és annyi 20%-os nátriumhidroxid oldatot adunk, hogy a fermentlé pH-értéke 8,8 legyen, majd 80 C°-ra melegítjük és 20 percig ezen a hőmérsékleten tartjuk. Ezután 350 ml 30%-os vas(III)-klorid oldatot csepegtetünk 60 hozzá, 15 percig keverjük, majd 20%-os nátriumhidroxid oldattal az elegy pH-értékét 7,8-ra állítjuk be. További 10 percig keverjük a rendszert, majd leszűrjük, jól leszívatjuk, kevés vízzel mossuk. A szüredék B12 -vitamin-tartalma 90 725 gamma. 65 Kitermelés: 95,0%. 7
