171245. lajstromszámú szabadalom • Eljárás szintetikus kalcitoninok vagy kalcitonin-származékok tisztítására
171245 7 8 . Peptidtartalom 89,0% Fluortartalom (mikroanalitikai módszerrel) 0,02% Aminosav analízis (6 n, 24 óra, 110°): minden aminosav a megfelelő moláris mennyiségben, kivéve a Ser, Thr, Cys, melyek a hidrolízis során részlegesen bomlanak, UV-színkép (10%-os ecetsavban): Amax =275 nm, s = 1540. 2. példa Tiszta kalcitonin M-trihidroklorid 1. Nyers kalcitonin M-trifluoracetát 58 g Boc— Cys—Gly—Asn—Leu—Ser(tBu)—Thr(tBu)—Cys— Met—Leu—Gly—Thr(tBu)—Tyr(tBu)—Thr(tBu)— —Gin—Asp(OtBu)—Phe—Asn—Lys(Boc)—Phe— His—Thr(tBu)—Phe—Pro—Gin—Thr(tBu)—Ala-Ile—Gly—Val—Gly—Ala—Pro—NH2 (14,3 mmól) vegyületet nitrogénatmoszférában 700 ml 85%-os trifluorecetsavban oldunk. Az oldatot két órán át 30° hőmérsékleten állni hagyjuk, majd 6 liter peroxidmentes éterrel jéghűtés közben elkeverjük. A csapadékot leszűrjük, éterrel mossuk, és nagy vákuumban szárítjuk. A nyers kalcitonin M-trifiuoracetátot színtelen porként kapjuk. 2. Kalcitonin M-belső só 43,5 g fentiek szerint előállított nyers kalcitonin M-trifluoracetátot 1 liter 1%-os ecetsavban oldunk, G—4-es üvegszűrőn leszűrjük, és ammóniával kicsapjuk a következők szerint: Az oldatot nitrogénatmoszférában szobahőmérsékleten keverjük, miközben a pH-értéket üvegelektróddal folyamatosan mérjük. Az oldathoz lassan körülbelül 1 n (t=0,97) ammóniumhidroxidoldatot adunk olyan módon, hogy 1 1/4 óra múlva pH 5 értéket érünk el. További egy óra aíatt a pH-értéket 6-ra emeljük, további ammóniumhidroxidoldat hozzáadásával. Ezen a ponton kezd el a kalcitonin M belső sója kicsapódni. A lassú ammóniumhidroxidoldat-adagolást tovább folytatva, egy óra múlva 7,6 pH-értéket érünk el. Ezután az elegyet további 3 órán át keverjük, melynek során a pH-érték többet nem változik. A csapadékot leszűrjük, pH 7,6 értékű híg ammóniumhidroxidoldattal mossuk, és nagy vákuumban szárítjuk. Ily módon 18,9 g vízben oldhatatlan port kapunk. Az anyag egy mintájának gázkromatográfiás vizsgálata 0,3 súlyszázalék ecetsavat mutat (megfelel 0,17 mól%-nak). 3, Kalcitonin M-trihidroklorid i27,3 g (8,0 mmól) kalcitonin M-belső sót 700 ml terc-butanalban szuszpendálunk. A szuszpenzióhoz 250 ml vizét és 360 ml 0,1 n sósavat (36 mmól) adunk, néhány percig keverjük, majd a zavaros oldatot G—4-es üvegszűrőn szűrjük. A szüredéket további 250 ml vízben oldjuk, és az első szűrlethez hozzászűrjük. Az összes szűrletet lehűtjük és liofilizáljuk. Levegőnedvességre történő egyensúlybahozás után 27,0 g kalcitonin M-trihidrokloridot kapunk. A termék a következő analitikai adatokkal rendelkezik: Vékonyréteg-kromatpgram cellulózon (Merck): Rf = 0,61 101A rendszerben Rf = 0,52 45 rendszerben Rf = 0,51 114 rendszerben aluminiumoxidon, 8% gipszadalékkal: > Rf = 0,72 79 rendszerben. Vékonyréteg-elektroforézis vizsgálatban egy folt jelentkezik 4,8 cm elmozdulással a katód felé, cellulóz-5 lemezen (Merck) pH = 1,9, áramsűrűség 9 V/cm, futtatásiidő: 3,5 óra. Ecetsavtartalom (gázkromatográfiásán vizsgálva) 0,05% alatt, víztartalom (Karl Fischer szerint) 8,5%, klórtartalom (2,80% (a vízmentes trihidrokloridra szá-10 mítva: 3,02%). UV-spektrum (10%-os ecetsavban): xmax =275 nm,e = 1440. A 3., 4. és 5. példában alkalmazott kiindulási anyagot a 2 413 106 számú német szövetségi köztársaságbeli nyilvánosságra hozatali irat (812 881 számú belga sza-15 badalmi leírás) szerint állíthatjuk elő. 3. példa 20 Tiszta Asn16 —Thr 27 -kalcitonin M-trihidroklorid 1. Nyers Asn26 —Thr^-kalcitonin M-trifluoracetát 5,8 g (1,41 mmól) Boc—Cys—Gly—Asn—Leu— —Ser(tBu)—Thr(tBu)—Cys—Met—Leu—Gly—Thr(tBu)—Tyr(tBu)—Thr(tBu)—Gin—Asp(OtBu)—Phe— —Asn—Lys(Boc)—Phe—His—Thr(tBu)—Phe—Pro— —Gin—Thr(tBu)—Asn—Thr(tBu)—Gly—Val—Gly— 30 —Ala—Pro—NH2 vegyületet nitrogénatmoszférában 70 ml 85%-os trifluorecetsavban 0° hőmérsékleten oldunk, majd két órán át 29—31° hőmérsékleten keverjük. Az oldatot 600 ml jéggel hűtött és peroxidmentes éterbe öntjük, erős keverés mellett, a keletkezett csapadékot 35 leszűrjük, és nagy vákuumban szárítjuk. 2. Asn26 —Thr 27 -kalcitonin M-belső só A fentiekben nyert száraz csapadékot 130 ml vízben oldjuk, G-4-es üvegszűrőn szűrjük, és híg ammóniumhidroxidoldattal kicsapjuk, a következőképpen: Az ol-40 datot nitrogénatmoszférában szobahőmérsékleten keverjük, és lassan körülbelül 1 n ammóniaoldatot (t =0,97) csepegtetünk hozzá. A pH-értékét üvegelektróddal folyamatosan mérjük. A csepegtetési úgy szabályozzuk, hogy 1,5 óra alatt a pH 5 értékre emelkedő 45 jék. Egy további óra alatt a pH értéket az ammóniumhidroxidoldat hozzácsepegtetésével 6-ra emeljük. Ekkor megindul a belső só kiválása. A híg ammóniumhidroxidoldat hozzáadagolását úgy folytatjuk, hogy egy további óra alatt 7,6-pH-értéket érjünk el. Ezután 50 az elegyet még három órán át keverjük, majd leszűrjük, és a szüredéket ammóniumhidroxidoldattal 7,6 pH-értékre állított vízzel mossuk. A maradékot nagy vákuumban szárítjuk. 55 3. Asn26 —Thr 27 -kalcitonin M-trihidroklorid A 2. pont szerint kapott, vízben oldhatatlan belső sót 80 ml víz—terc-butanol (1:1) elegyben szuszpendáljuk. A szuszpenzióhoz 39,0 ml 0,1 n sósavat adunk, egy ideig keverjük, majd szűrjük. A szüredéket több-60 szőr, összesen 120 ml víz—terc-butanol 1:1 eleggyel mossuk, majd liofilizáljuk. Ily módon színtelen liofilizátumot kapunk, melyet a levegő nedvességtartalmával egyensúlyba hozunk. Kitermelés: 3,13 g. A termék a következő analitikai adatokkal rendel ke-65 zik: 4
