171245. lajstromszámú szabadalom • Eljárás szintetikus kalcitoninok vagy kalcitonin-származékok tisztítására
9 171245 10 Vékonyréteg-kromatogram cellulózon (Merck): Rf = 0,41 114 rendszerben Rf = 0,36 45 rendszerben Rf = 0,55 101A rendszerben alumíniumoxidon, 8% gipszadalékkal: Rf = 0,49 52 rendszerben. Vékonyréteg-elektroforézis vizsgálatban cellulózlemezen (Merck), pH 1,9 értéken (hangyasav—ecetsav—pufferrel), 9 V/cm áramsűrűség és 3,5 óra futtatási idő mellett az elmozdulás 4,8 cm. 4. példa Tiszta Thr27 -kalcitonin M-acetát 80 mg nyers Thr27 -kalcitonin M-acetátot 5 ml vízben oldunk, és keverés közben részletekben összesen 1,2 ml Merck-ioncserélőt (II. sz.) (gyengén bázikus, szabad aminformájú) adunk hozzá. Az oldat pH-értéke a kezdeti 4,6 értékről 6,1-re emelkedik. Az elegyet további két órán át szobahőmérsékleten keverjük, mikor is pelyhes csapadék válik ki, és az oldat pH-értéke 7,l-re emelkedik. Az elegyet ezen a pH-értéken még további fél órán át keverjük, majd a csapadékot és ioncserélőt együtt leszívatjuk, és vízzel alaposan utánamossuk. Ezután a pepiidet úgy választjuk el az ioncserélőtől, hogy a még nedves keveréket 15 ml 90%-os ecetsavval 60° hőmérsékleten keverjük, majd az ecetsavas oldatot leszívatjuk. Az eluátum liofilizálásával 74 mg Thr27-kalcitonin M-acetátot kapunk, igen nagy tisztasággal. Az anyag Rf -értéke cellulóz-lemezen végzett vékonyrétegkromatográfiás vizsgálat során 52 rendszerben 0,50, alumíniumoxid-lemezen 101A rendszerben 0,52. Vékonyréteg-elektroforézis vizsgálatban (pH = 1,9, 280 V, 2 órás futtatási idő) elmozdulás 4,4 cm a katód felé. Ecetsavtartalom: 4,22% (gázkromatográfiásán). Víztartalom: 7,78% (Karl Fischer szerint). Peptidtartalom: 87,4% (titrimetriásan meghatározva). UV-spektrum: Xmax =276 nm, e = 1560 (c =25%-os ecetsavban, 87,4% peptidtartalomra számítva). Aminosav mólarány teljes hidrolízissel megállapítva (6 n sósav, 24 óra, 110°) (a számított értéke zárójelben): Lys: 0,93 (1), His: 0,95 (1), NH3: 3,40 (4), Asp: 3,00 (3), Thr: 5,23 (6), Ser: 1,17 (1), Gin: 2,02 (2), Pro: 2,06 (2), Gly: 3,87 (4), Ala: 2,03 (2), 1/2 (Cys)2: 2,13 (2), Val: 1 (alapérték), Met: 1,07 (1), Leu: 1,82 (2), Tyr: 0,99 (1), Phe: 3,06 (3). 5. példa Leu12 —Asn 26 —Thr 27 -kalcitonin M-acetát 170 mg Boc—Cys—Gly—Asn—Leu—Ser(tBu)— —Thr(tBu)—Cys—Met—Leu—Gly—Thr(tBu)—Leu— —Thr(tBu)—Gin—Asp(OtBu)—Phe—Asn—Lys(Boc) —Phe—His—Thr(tBu)—Phe—Pro—Gin—Thr(tBu)— —Asn—Thr(tBu)—Gly—Val—Gly—Ala—Pro—NH2 vegyületet 5 ml 90%-os trifiuorecetsavban oldunk, 90 percen át 25° hőmérsékleten állni hagyjuk, a peptid--trifluoracetátot peroxidmentes éterrel kicsapjuk, leszívatjuk, éterrel utánamossuk, szárítjuk, és 1%-os ecetsavban oldjuk. Az oldatot ezután egy enyhén bázikus, acetátformájú Merck-ioncserélővel töltött oszlopon en.-5 gedjük át, 1%-os ecetsavval eluáljuk, és a liofilizátumot eluáljuk (116 mg). Tisztítás céljából a keletkezett acetátot 5 ml vízben oldjuk (az oldat pH-ja 4,2), és keverés közben összesen 2,8 ml II. sz. Merck-ioncserélőt (enyhén bázikus, bázisformájú) adunk hozzá. Eközben 10 az oldat pH-ja lassan emelkedik, és 6,7 érték elérésével a szabad peptid kicsapódni kezd. Az elegyet összesen 2 órán át keverjük, miközben a pH 7é l értékre emelke-^ dik. A csapadékot és az ioncserélőt ezután együtt leszívatjuk, vízzel utánamossuk, és a peptidet az ioncseré-15 lőtől 60°-os 90%-os ecetsavval történő keveréssel választjuk el. Az elegyet leszívatjuk, a szüredéket 90%-os ecetsavval mossuk, és a szűrletet liofilizáljuk. Ily módon 98 mg nagy tisztaságú Leu 12—Asn 26 —Thr^-kalcitonin M-acetátot kapunk. 20 Vékonyréteg-kromatográfiás vizsgálat cellulózon: Rf = 0,33 101A rendszerben, alumíniumoxidon: Rf = 0,47 52 rendszerben. 25 6. példa Tiszta kalcitonin M-acetát 110 mg nyers kalcitonin M-acetátot 5 ml vízben ol-30 dunk, és az oldathoz részletekben keverés közben 1 óra alatt 1,0 ml III. sz. Merck-ioncserélőt (erősen bázikus) adunk. Eközben az oldat hőmérséklete 6,6-re emelkedik, és megkezdődik a kalcitonin M kiválása. További, szobahőmérsékleten végzett keverés során a pH-érték 35 7,3-re emelkedik, és itt megáll. Ekkor az ioncserélőt és a kicsapódott peptidet együtt leszűrjük, vízzel utánamossuk és a peptidet az ioncserélő mellől meleg 90%-os ecetsav hozzáadásával kioldjuk, majd liofilizáljuk. Ily módon nagy tisztaságú kal-40 citonin M-acetátot kapunk, melynek analitikai adatai megegyeznek az 1. példában megadottakkal. Szabadalmi igénypontok 45 1. Eljárás szintetikusan előállított, 5 és 10 közötti pH-értéknek megfelelő izoelektromos ponttal rendelkező kalcitoninok és kalcitonin-származékok tisztítására, azzal jellemezve, hogy a kalcitonint vagy kalcitonin-50 származékot valamely savval vagy bázissal alkotott sójának vizes oldatából a pH-nak az izoelektromos tartományba történő beállításával belső sójaként csapjuk ki, és kívánt esetben önmagában ismert módon valamely vízben oldódó sójává alakítjuk át. 55 2. Az 1. igénypont szerinti eljárás foganatösítási módja, azzal jellemezve, hogy kiindulási anyagként kalcitonin M valamely sóját használjuk. 3. Az 1. igénypont szerinti eljárás foganatösítási módja, azzal jellemezve, hogy kiindulási anyagként a 60 kalcitonin M valamely analógjának egy sóját használjuk. 4. A 2. vagy 3. igénypont szerinti eljárás foganatösítási módja, azzal jellemezve, hogy kiindulási anyagként a kalcitoninok vagy kalcitonin-származékok valamely 65 dezamino1 -származékának egy sóját használjuk. 5
