171245. lajstromszámú szabadalom • Eljárás szintetikus kalcitoninok vagy kalcitonin-származékok tisztítására
5 171245 6 vábbi két óra múlva a pH körülbelül 7,5-re emelkedik, itt azonban már konstans marad. A peptid teljes kicsapódása után azt elválasztjuk, például leszívatva vagy centrifugálva, és vízzel alaposan átmossuk. Mivel a kicsapott peptid vízben igen rosszul oldódik, a mosás során gyakorlatilag veszteség nem lép fel. Ha a kicsapást ioncserélő hozzáadásával végeztük, a szabad peptidet az ioncserélőtől el kell választani. Ez például úgy történhet, hogy a peptidet savval egy kívánt sójává alakítjuk, például acetáttá vagy hidrokloriddá, az oldatot például szűréssel vagy leszívatással elválasztjuk az ioncserélőtől, majd liofilizáljuk. Ha nem ioncserélővel dolgoztunk, a kicsapott terméket savban oldva, majd liofilizálva a kívánt sóvá alakíthatjuk át. Gyógyászatilag alkalmazható sók előállítására alkalmas savak például a szervetlen savak, például halogénhidrogénsavak, például a sósav vagy hidrogénbromid, perklórsav, salétromsav vagy tiociánsav, a kén- vagy foszforsavak, vagy szerves savak, például a hangyasav, ecetsav, propionsav, glikolsav, tejsav, piroszőlősav, oxálsav, maionsav, borostyánkősav, maleinsav, fumársav, almasav, borkősav, citromsav, aszkorbinsav, hidroximaleinsav, dihidroximaleinsav, benzoesav, fenilecetsav, 4-aminobenzoesav, antranilsav, fahéjsav, mandulasav, szalicilsav, 4-aminoszalicilsav, 2-fenoxibenzoesav, metánszulfonsav, etánszulfonsav, hidroxietánszulfonsav, benzolszulfonsav, p-toluolszulfonsav, naftalinszulfonsav vagy szulfanilsav. A találmány szerinti eljárással előállított peptidek gyógyászati készítmény alakban alkalmazhatók. Ezek a peptideket egy például intravénás, intramuszkuláris, szubkután, vagy intranszális adagolásra alkalmas, szerves vagy szervetlen, gyógyászatilag alkalmazott hordozóanyaggal keverve tartalmazzák. Ilyen hodrozóanyagként olyan anyagok jöhetnek számításba, melyek a polipeptidekkel nem reagálnak, mint például a zselatin, agar-agar, tragant, cellulóz, például az „Avicel" (mikrokristályos cellulóz) és cellulózszármazékok, például a karboximetilcellulóz, cellulózéterek, például a metilvagy etilcellulóz, polialkilén-glikolok, például a propilénglikol, víz, egy- vagy többértékű alkoholok, például az etanol, izopropanol, glicerin, hexit, növényi olajok és más zsírsavészterek, például arachidoláj, gyapotmagolaj, mandulaolaj, olívaolaj, ricinusolaj, etiloleát, ízopropilmírisztát, izopropilpalmitát, „Celitol V" (folyékony zsíralkoholok olajsavésztere), „Miglyol" vagy „Labrafac" (8—12 szénatomos zsírsavak trigliceridjeinek elegye), „Labrafil M 2735" vagy „Labrafac WL 1219" (glicerin és polioxietilén-zsírsavészterek elegye), „Tween" (polioxietilénszorbitán-monooleát), szilikonolajok, például dimetilszilikonolaj, vagy más ismert gyógyszerhordozók. A gyógyászati készítmények például liofilizátumként vagy folyékony formában oldat, szuszpenzió, emulzió vagy spray alakban állhatnak, lásd például a 2 212 315 számú német szövetségi köztársaságbeli nyilvánosságra hozatali iratot. A készítmények adott esetben sterilizáltak és/vagy segédanyagokat, például konzerváló-, stabilizáló-, nedvesítő- vagy emulgeálószereket tartalmaznak. Tartalmazhatnak ezenkívül még más gyógyászatilag értékes anyagokat is. A találmány szerinti eljárást a következő példákban részletesen ismertetjük. A hőmérsékleti értékeket Celsius fokban adjuk meg. A vékonyréteg-kromatográfiás vizsgálatok során a következő rendszereket használtuk: 43C: terc-amilalkohol—izopropanol—víz (51:21:28) 45: szek-butanol—3%-os vizes ammóniaoldat 5 (70:30) 52: n-butanol--jégecet—víz (75:7,5:21) 52A: n-butanol—jégecet—víz (67:10:23) 70: etilacetát—piridin—víz (40:20:40) felső fázis 79: n-butanol—piridin—víz (34:33:33) 10 96: szek-butanol—jégecet—víz (67:10:23) 100: etilacetát—piridin—jégecet—víz (62:21:6:11) 101A: n-butanol—piridin—jégecet—víz (42:24:4:30) 102A: etilacetát—metiletilketon—hangyasav—víz (50:30:10:10) 15 107: etilacetát—piridin—víz (49:24:27) 114: szek-butanol—metiletilketon-~-25%-os vizes ammóniaoldat—víz (37:37:13:13) 121: izopropanol—25%-os vizes ammóniaoldat—víz (70:10:20) 20 121A: izopropanol-^-25%-os vizes ammóniaoldat—vlz (85:5:10) DS: futtatás SL 254 szilikagél-készlemezeken, gyártja Camag cég, Birsfelden. DC: futtatás cellulóz-készlemezeken, gyártja Merck 25 cég, Därmstadt. DA: futtatás Alox-lemezeken (45 g Camag, Muttenz gyártmányú A120 3 + 3,5 g gipsz, rétegvastagság 0,3 mm). A példákban a következő rövidítéseket használjuk: 30 Boc terc-butiloxikarbonil-csoport, Z benziloxikarbonilcsoport, —OtBu terc-butilésztercsoport, —ONp p-nitrofenilésztercsoport, —OMe metilésztercsoport, 35 —OSu hidroxiszukcinimidésztercsoport, —tBu terc-butilétercsoport, DMF dimetilformamid. 40 1. példa Tiszta kalcitonin M-acetát 50 mg nyers kalcitonin M-trifluoracetátot (lásd 45 737 890 számú belga szabadalmi leírás) oldunk 5 ml vízben. Az oldat pH-értékét 2,5-re állítjuk. Keverés közben 15 perc alatt kis részletekben összesen 0,6 ml II. sz. Merck-ioncserélőt adunk hozzá (gyengén bázisos) szabad bázis formában. Eközben az oldat pH-ér-50 teke 6,2-re emelkedik. A reakcióelegyet 30 percen át keverjük tovább szobahőmérsékleten, eközben az oldat pH-értéke 7,5-re emelkedik és pelyhes csapadék kezd kiválni. Három óra eltelte után a csapadékot és az ioncserélőt leszűrjük, és vízzel utánamossuk. A mosóvíz 55 12 mg anyagot tartalmaz, mely a kalcitonin M mellékterméke. A kicsapódó kalcitonin M-et úgy választjuk el az ioncserélőtől, hogy négyszer mossuk 4—4 ml 90%-os ecetsavval és minden mosás után szűrést is végzünk. 60 Az egyesített ecetsavas extraktumot liofilizáljuk, így 36 mg kalcitonin M-acetátot kapunk. A termék a következő analitikai adatokkal rendelkezik: Víztartalom (Karl Fischer szerint) 8,1% 65 Ecetsavtartalom (gázkromatográfiásán) 1,1% 3
