171245. lajstromszámú szabadalom • Eljárás szintetikus kalcitoninok vagy kalcitonin-származékok tisztítására
3 171245 4 a szokásos eljárásoknál. A keletkezett termék teljes biológiai hatást mutat. : A találmány szerinti eljárás nem volt előre látható, mivel más hosszúláncú peptidek, például az ACTH, inzulin, glükagon, ilyen módszerrel nem tisztíthatók. Kalcitonin-típusú, pl = 5—10 értékű izoelektromos ponttal rendelkező peptid mindenekelőtt az emberi kalcitonin (kalcitonin M) és származékai, valamint analógjai, például melyeket a 737 890, 740 256, 757 786 számú belga szabadalmi leírás ismertet. Mindenekelőtt az olyan analógok említendők, melyek a métionin8 -csoport helyett egy a-(rövidszénláncú)-a-amino-ecetsavcsoportot tartalmaznak, főleg olyat, melyben a rövidszénláncú alkilcsoport 2—4 szénatomos, mint például főleg valint, továbbá norvalint, leucint, izoleucint, norleucint vagy a-aminovajsavat. További előnyös olyan aminosavak, melyek a 8-helyzeten kívül ugyancsak más aminsavval lehetnek helyettesítve: az L-lizin11 , L-leucin12 , L-leucin 16 , L-leucin 19 , L-tirozin 22 , L-aszparagin 26 és L-treonin27 . Származékok mindenekelőtt a megfelelő dezamino1 -peptidek, valamint az N a -acil-származékok. Az Na -amino-csoport acilezésére alkalmas acilcsoportok a karbonsavak acilcsoportjai, például az alifás, aromás, aralifás, heterociklusos vagy heterociklusos-alifás karbonsavak, főleg az egy- és kétértékű rövidszénláncú alkán- vagy alkénsavak, mindenekelőtt az 1—4 szénatomos rövidszénláncú alkánkarbonsavak, például hangyasav, ecetsav, propionsav, vajsavak, valamint az akrilsav, borostyánkősav, az aliciklusos karbonsavak, például a szubsztituálatlan vagy szubsztituáít benzoesav vagy ftálsav, a szubsztituálatlan vagy aril-szubsztituált aril-(rövidszénláncú)-alkil- vagy -alkenil-karbonsavak, például a fenilecetsav, a szubsztituálatlan vagy szubsztituáít egy- vagy kétértékű 5-6 tagú, heteroatomként nitrogén-, kén- és/vagy oxigénatomot tartalmazó heterociklusos savak, például piridinkarbonsavak, tiofénkarbonsavak, vagy heterociklusos-(rövidszénláncú)-karbonsavak, például a piridilecetsav, imidazolilecetsav acilcsoportjai, ahol a gyűrűk szubsztituensei például halogénatomok, nitrocsoportok, rövidszénláncú alkil-, rövidszénláncú alkoxi- vagy rövidszénláncú alkoxikarbonilcsoportok lehetnek. Számításba jöhetnek ezenkívül mindenekelőtt az aminosavak acilcsoportjai, például a glicil-, L-leucil- vagy L-piroglutamilcsoport, valamint a szénsavból és tioszénsavból, illetve azok észtereiből és amidjaiból származó acilcsoportok, például a rövidszénláncú alkoxikarbonilcsoportok, például az etoxikarbonil-, terc-butiloxikarbonil-, valamint a szubsztituálatlan vagy mindenekelőtt a fentiekben megadottak szerint szubsztituáít benziloxikarbonil-, karbamoilvagy tiokarbamoilcsoportok, valamint az N-szubsztituált karbamoil- és tiokarbamoilcsoportok, például az N-(rövidszénláncú)-alkilkarbamoil-, N-fenil-karbamoilvagy N-fenuMiokarbamoil-csoportok. Az emberi kalcitonin izoelektromos tartománya pH 7 és 8 között van. Az izoelektromos tartomány változását az egyes aminosavhelyettesítések esetén kísérletileg, például elektroforézissel állapíthatjuk meg, vagy számíthatjuk. A peptidek izoelektromos pontja például J. Greenstein és M. Winitz szerint számítható, lásd „Chemistry of the Amino Acids", 1. kötet, John Wiley and Sons, Inc., New York, London, 1961, 482. old. A peptidek sóiként, melyek a találmány szerinti eljárás során kiindulási anyagként használhatók, minden olyan só számításba jöhet, amely vízben vagy adott esetben víz és egy szerves peptid-oldószer, például egy rövidszénláncú alkanol, főleg metanol, etanol, izopropanol, terc-butanol vagy dimetilformamid vagy dimetilacetamid elegyében oldódik. Ilyen sók például az ás-5 ványi savakkal, főleg a halogénhidrogénsavakkal, vagy szerves savakkal, mindenekelőtt ecetsavval és halogénezett ecetsavakkal, például trifluorecetsavval, diklórecetsavval, továbbá szulfonsavakkal, pétdául rövidszénláncú alkánszulfonsavakkal, például metánszulfonsav-10 val, vagy benzol- vagy toluolszulfonsavakkal alkotott sók. A peptid bázissal, például ammóniával vagy primer, szekunder, tercier vagy kvaterner aminokkal, például olyan megfelelő aminokkal, melyek szerves csoportként egy vagy több rövidszénláncú alkil-, cikloal-15 kii- (előnyösen 5 vagy 6 gyűrűatomos), vagy aralkil-, előnyösen fenil-(rövidszénláncú)-alkil-csoportot tartalmaznak, például trietilaminnal, ciklohexilaminnal, diciklohexilaminnal, benzilaminnal, trimetilbenzilammóniumhidroxiddal, továbbá az említett szerves csopor-20 tokkal szubsztituáít guanidinnel, például tetrametilguanidinnel alkotott sói ugyancsak alkalmazhatók. A peptidet elsősorban olyan sójaként alkalmazzuk, mely önmagában a szintézis során képződött, például hidroklorid, hidrobromid, hidrofluorid, trifluoracetát 25 vagy acetát alakban. Kívánt esetben a sókat, amelyként a peptid keletkezett, a tisztítási művelet előtt acetátjává alakítjuk át, például ioncserélővel. A sót vízben vagy víz és egy szerves peptid-oldószer elegyében oldjuk. Az oldat pH-értékét megmérjük, és 30 attól függően, hogy a peptid savval vagy bázissal alkotott sójaként van jelen, addig adunk hozzá bázist vagy savat, míg elérjük az izoelektromos tartományt. Bázisként például ammóniát, vizes alkálihidroxidokat, főleg nátrium- vagy káliumhidroxidot, alkálifémkarbonáto-35 kat vagy -hidrogénkarbonátokat, például nátriumkarbonátot vagy -hidrogénkarbonátot, szerves bázisokat, például a fentiekben említett aminokat vagy bázikus ioncserélőket használunk. Ilyen célra a gyengén bázikus, közepesen vagy erősen bázikus ioncserélők egy-40 aránt alkalmazhatók. Ilyen ioncserélőket megfelelő alapvegyületek polimerizálásával vagy bázikus csoportoknak polimerekbe történő bevitelével állíthatunk elő. Előnyösen kereskedelemben kapható készítményeket használunk, például cellulóz-bázisú, például DEAE-cel-45 lulóz- vagy DEAE-Sephadex-típusú ioncserélőket. Különösen alkalmas ioncserélők a polisztirol-bázisúak, melyek különböző cégektől származnak, például az enyhén bázikus II. számú Merck-ioncserélő, vagy az erősen bázikus III. sz. Merck-ioncserélő, a különböző tí-50 pusú bázikus Dowex-ioncserélők, vagy a bázikus Amberlite-gyanták. Ha az izoelektromos tartományt savakkal kell beállítani, például ásványi savakat, mindenekelőtt halogénhidrogénsavakat, főleg sósavat vagy szerves savakat, például ecetsavat vagy citromsavat, 55 vagy a fenti bázikus ioncserélőknek megfelelő savas ioncserélőket, például polisztirol-bázisú Amberlite IR—• 120 vagy Dowex 50 ioncserélőket használhatunk. Az izoelektromos tartomány elérésével a peptid ki-60 csapódás lassan megindul. A kicsapódást több órán, például két órán át hagyjuk végbemenni. Ez idő alatt a pH-érték körülbelül egy egységet emelkedik. így például a kalcitonin-M-acetát pH-értéke körülbelül 4. Ez enyhén bázikus ioncserélő hozzáadásával 6,0—6,2 ér-65 tékre emelkedik. így megkezdődik a kicsapódás. To-2
