171243. lajstromszámú szabadalom • Eljárás új dotriakontapeptidamidok előállítására

171243 29 30 leoldása céljából, 60 °C-ra melegített 90%-os ecetsavval elkeverjük. Az elegyet leszűrjük, 90%-os ecetsavval mossuk és liofilizáljuk. Az eljárással nagy tisztaságban, 98 mg Leu

12—Asn

26

—Thr

27

—kalcitonin M acetátot kapunk. DC:Rf(101A)=0,33; DA: R

f(52) = 0,47. Az itt leírt izoelektromos pont körüli, peptidkicsapásos eljárást a 3 948 876 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás írja le. A kiindulási anyagként alkalmazott védett peptidet a következő módon állíthatjuk elő: a) Z—Thr(tBu)—Leu—Thr(tBu)—Gin—Asp-(OtBu)—Phe—Asn—Lys(Boc)—Phe—His—Thr(tBu)— —Phe—Pro—Gin—Thr(tBu)—Asn—Thr(tBu)—Gly— —Val—Gly—Ala—Pro—NH2 380 mg Z—Thr(tBu)—Leu—Thr(tBu)—Gin—Asp(OtBu)—Phe—NHNH2-t (lásd 7. példa) 5 ml dimetil-formamidban keverés és 70 °C hőmérsékletre történő melegítés közben oldunk, az oldatot —20 °C hőmérsékletre hűtjük, 0,265 ml 3,71 n sósav-oldatot (dioxánban) és ezután 0,051 ml terc-butil-nitritet adunk hozzá, és 10 percig —10 °C hőmérsékleten reagáltatjuk. A reakcióelegyhez ezután —10 °C-ra hűtött H—Asn— —Lys(Boc)—Phe—His—Thr(tBu)—Phe—Pro—Gin— —Thr(tBu)—Asn—Thr(tBu)—Gly—Val—Gly—Ala— —Pro—NH2—acetát (lásd 1. példa

n) eljárás) és 5 ml dimetil-formamid oldatát és 0,20 ml N-etil-diizopropil-amint adunk és 1 óra hosszat 0 °C hőmérsékleten keverünk. A reakcióelegyhez ezen idő alatt további 0,07 ml N-etil-diizopropil-amint adunk, majd az elegyet szobahőmérsékletre felmelegedni hagyjuk, 1 óra hoszszat 25 °C hőmérsékleten és 20 óra hosszat 5 °C hőmérsékleten állni hagyjuk, miközben kocsonyás csapadék képződik. Az anyagot 100 ml jeges víz hozzáadásával kicsapjuk, 1 óra hosszat 0 °C hőmérsékleten állni hagyjuk, majd a csapadékot leszűrjük, vízzel mossuk és szárítjuk. A kapott port éterrel eldörzsöljük, leszűrjük és ismét szárítjuk. A nyers terméket (színtelen por) tisztítás céljából egyszer dimetil-formamid és víz elegyből és kétszer dimetil-formamid és aceton elegyből kicsapjuk. Az eljárással 440 mg terméket kapunk. DS: Rf(70)=0,52; Rf(100) = 0,3l;,

R

f

(96)=0,40. b) H—Thr(tBu)—Leu—Thr(tBu)—Gin—Asp-(OtBu)—Phe—Asn—Lys(Boc)—Phe—His—Thr(tBu)— —Phe—Pro—Gin—Thr(tBu)—Asn—Thr(tBu)—Gly— —Val—Gly—Ala—Pro—NH2 Az a) eljárás szerint előállított 260 mg terméket 25 ml 80%-os ecetsavban, 50 mg 10%-os palládium-csontszén jelenlétében, szokásos módon hidrogénezünk. Az ecetsav eltávolítására a 266 mg gyantaszerű terméket 20 ml vízzel telített n-butanolban oldjuk, többször nátrium-karbonát-oldattal, hígított nátrium-klorid-oldattal és vízzel mossuk, majd a butanolos fázist bepároljuk. Kitermelés 199 mg. DS: Rf(100) = 0,13; Rf

(96) = 0,36. c) Boc—Cys—Gly—Asn—Leu—Ser(tBu)—Thrí (tBu)—Cys—Met—Leu—Gly—Thr(tBu)—Leu— —Thr(tBu)—Gin—Asp(OtBu)—Phe—Asn— —Lys(Boc)—Phe—His—Thr(tBu)—Phe—Pro— —Gin—Thr(tBu)—Asn—Thr(tBu)—Gly—Val— —Gly—Ala—Pro—NH2 102 mg Boc—Cys—Gly—Asn—Leu—Ser(tBu)—Thr-5 í -(tBu)—Cys—Met—Leu—Gly—OH, 199 mg H—Thr-(tBu)—Leu—Thr(tBu)—Gin—Asp(OtBu)—Phe— —Asn—Lys(Boc)—Phe—His—Thr(tBu)—Phe—Pro— —Gin—Thr(tBu)—Asn—Thr(tBu)—Gly—Val—Gly— 10 —Ala—Pro—NH2, 16 mg N-hidroxi-szukcinimid és 3 ml dimetil-formamid elegyéhez keverés közben, 27 mg diciklohexil-karbodiimidet adunk, 6 óra hosszat 45 °C hőmérsékleten keverjük, majd az elegyet jéggel hűtött éterre öntjük és 0 °C hőmérsékleten tartva, 2 óra után 15 a csapadékot leszűrjük, éterrel mossuk és szárítjuk. A kapott port melegítéssel 5 ml dimetil-formamidban oldjuk, szobahőmérsékletre lehűtjük és a terméket 50 ml etil-acetát hozzáadásával kicsapjuk. A csapadékot leszűrjük, etil-acetáttal mossuk, szárítjuk, majd a kapott 20 port melegítéssel 10 ml dimetil-formamid és metanol (1:1) elegyben oldjuk, jéggel lehűtjük és jeges víz hozzáadásával kicsapjuk. Az elegyet 0 °C hőmérsékleten tartva, 17 óra után a finom csapadékot leszűrjük, vízzel mossuk és vákuumban kalcium-kloridon szárítjuk. 25 Az eljárással 175 mg címben megadott, védett dotriakontapeptidet kapunk. DS: Rj<107)=0,60; Rf(52A) = 0,23; R,<100) = 0,22. 30 9. példa I I H—Cys—Gly—Asn—Leu—Ser—Thr—Cys—Met— —Leu—Gly—Thr—Tyr—Thr—Gin—Asp—Phe— 35 —Asn—Lys—Phe—His—Thr—Phe—Pro—Gin— —Thr—Asn—He—Gly—Val—Gly—Ala—Pro— —NH2

—acetát (Asn26

—kalcitonin M acetát) 2,5 ml 90%-os trifluor-ecetsavhoz jéghűtés, keverés és nitrogéngázbevezetés közben 115 mg finoman poríi : " tott Boc—Cys—Gly—Asn—Leu—Ser(tBu)—Thr(tBu)I —Cys—Met—Leu—Gly—Thr(tBu)—Tyr(tBu)—Thr-45 (tBu)—Gin—Asp(OtBu)—Phe—Asn—Lys(Boc)— —Phe—His—Thr(tBu)—Phe—Pro—Gin—Thr(tBu)— —Asn—He—Gly—Val—Gly—Ala—Pro—NH2-t adunk. A peptid oldódása után az oldatot 21 °C hőmérsékletre felmelegedni és 90 percig állni hagyjuk. 50 A reakcióelegyet ezután 50 ml jéggel hűtött, peroxidmentes éterre öntjük, leszűrjük és szárítjuk. 84 mg Asn26

—kalcitonin M trifluor-ecetsavas sót kapunk. Acetáttá történő átalakításra a terméket 1%-os ecetsavban oldjuk és Merck-féle ioncserélő II. sz. (gyengén 55 bázisos, acetátforma) gyantával töltött oszlopon szűrjük. Az eluátum liofilizálásával 75 mg Asn26

—kalcitonin M acetátot kapunk. A termék totálhidrolízise (6 n sósav-oldat, 24 óra, 110 C

C) a várt aminosavarányt mutatja. 60 Vékonyréteg-kromatográfiával cellulózlemezen a következő értékeket kapjuk (zárójelben az összehasonlítási kalcitonin M értékeket adjuk meg): Rf

(101A)=0,55 (0,60); Rj(112A) = 0,58 (0,62). A kiindulási anyagként alkalmazott védett peptidet 65 a következő módon állíthatjuk elő: 15