171243. lajstromszámú szabadalom • Eljárás új dotriakontapeptidamidok előállítására
27 171243 28 Olvadáspont: 197—199 °C. Hidraziddá történő átalakításhoz az előbbiek szerint előállított 13,9 g Z—Thr(tBu)—Leu—Thr(tBu)—Gin— —Asp(OtBu)—Phe—OMe-t 700 ml metanolban oldjuk, 70 ml hidrazin-hidrátot adunk hozzá és 45 percig szobahőmérsékleten állni hagyjuk. A reakcióelegyet vákuumban 300 ml térfogatra betöményítjük és az anyagot 500 ml víz hozzáadásával kicsapjuk. A csapadékot leszűrjük, vízzel semlegesre mossuk és szárítjuk. A kapott 13,5 g nyers hidrazid tisztítására az anyagot dimetil-formamid és víz elegyből ismét kicsapjuk és metanolból átkristályosítjuk. Az eljárással 11 g kristályos terméket kapunk. Olvadáspont: 225—227 °C. b) Z—Thr(tBu)—Leu—Thr(tBu>—Gin—Asp(OtBu)—Phe—Asn—Lys(Boc)—Phe—His—Thr(tBu)— —Phe—Pro—Gin—Thr(tBu)—Ala—Thr(tBu)—Gly— —Val—Gly—Ala—Pro—NH2 4,00 g Z—Thr(tBu)—Leu—Thr(tBu)—Gin—Asp-(OtBu)—Phe—NHNH2 és 25 ml dimetil-formamid szuszpenzióját melegítés közben 70 °C hőmérsékleten addig keverjük, míg az anyag fel nem oldódik. Az oldatot ezután —20 °C hőmérsékletre lehűtjük, 2,50 ml 3,70 n sósav-oldatot (dioxánban) adunk hozzá, majd 0,48 ml terc-butil-nitritet csepegtetünk az elegyhez, — 20 °C hőmérsékletre keverés közben lehűtjük, —10 °C hőmérsékletre felmelegedni hagyjuk és további 15 percig ezen a hőmérsékleten keverjük. A reakcióelegyhez ezután —10 °C hőmérsékletre hűtött, 4,2 g H—Asn— —Lys(Boc)—Phe—His—Thr(tBu)—Phe—Pro—Gin— —Thr(tBu)—Ala—Thr(tBu)—Gly—Val—Gly—Ala— —Pro—NH2—acetát és 50 ml dimetil-formamid oldatát és 1,6 ml N-etil-diizopropil-amint csepegtetünk, 0 °C hőmérsékletre felmelegedni hagyjuk és további 60 percig keverjük, mi mellett lassan további 0,8 ml N-etil-diizopropil-amint csepegtetünk az elegyhez. A reakcióelegyet 17 óra hosszat 23 °C hőmérsékleten reagáltatjuk, miközben kocsonyás csapadék képződik. Az elegyhez ezután 500 ml jéghideg, peroxidmentes étert adunk, a csapadékot leszűrjük, éterrel mossuk és szárítjuk. A terméket 200 ml jeges vízzel eldörzsöljük, leszűrjük, szárítjuk, majd háromszor dimetil-formamid és víz elegyből és kétszer dimetil-formamid és etil-acetát elegyből kicsapjuk. Az eljárással 4,98 g terméket kapunk. DS: Rf(70) = 0,61; Rf(100) = 0,38. c) H—Thr(tBu)—Leu—Thr(tBu)—Gin—Asp(OtBu)—Phe—Asn—Lys(Boc)—Phe—His—Thr(tBu)— —Phe—Pro—Gin—Thr(tBu)—Ala—Thr(tBu)—Gly— —Val—Gly—Ala—Pro—NH2 A b) eljárás szerint előállított 3,0 g terméket 200 ml 90%-os ecetsavban oldjuk és a szokásos módon 0,5 g palládium-csontszén (10%-os) jelenlétében hidrogénezzük. Az ecetsav eltávolítására a kapott ecetsavas sót 200 ml vízzel telített, n-butanolban oldjuk, az oldatot többször hígított nátrium-karbonát-oldattal, hígított nátrium-klorid-oldattal, és végül vízzel mossuk. A butanolos oldat mosásánál keletkező erős emulziót centrifugálással választjuk szét. A butanolos oldat szárazra párlásával, mint színtelen gyantát, 2,15 g H—Thr(tBu)— —Leu—Thr(tBu)—Gin—Asp(OtBu)—Phe—Asn— —Lys(Boc)—Phe—His—Thr(tBu)—Phe—Pro—Gin— —Thr(tBu)—Ala—Thr(tBu)—Gly—Val—Gly—Ala— —Pro—NH2-t kapunk. DS: Rf(96) = 0,37; Rf (100)=0,19. d) Boc—Cys—Gly—Asn—Leu—Ser(tBu)—Thr(tBu)—Cys—Met—Leu—Gly—Thr(tBu)—Leu— —Thr(tBu)—Gin—Asp(OtBu)—Phe—Asn—Lys(Boc)—Phe—His—Thr(tBu)—Phe—Pro—Gin—Thr(tBu)—Ala—Thr(tBu)—Gly—Val—Gly—Ala—Pro— —NH2 A c) eljárás szerint előállított 2,01 g termék, 1,00 g Boc—Cys—Gly—Asn—Leu—Ser(tBu)—Thr(tBu)— í —Cys—Met—Leu—Gly—OH, 250 mg N-hidroxi-szukcinimid és 30 mg dimetil-formamid elegyéhez keverés 20 közben 400 mg diciklohexil-karbodiimidet adunk és 6 óra hosszat 43 °C hőmérsékleten keverjük. Az elegyet ezután 3 óra alatt 0 °C hőmérsékletre hűtjük, a kivált diciklohexil-karbamidot leszűrjük és a szűrletet 250 ml jéggel hűtött, peroxidmentes éterre öntjük. A csapadé-25 kot leszűrjük, éterrel mossuk és szárítjuk. A terméket tisztítás céljából háromszor dimetil-formamid és víz elegyből, majd háromszor dimetil-formamid és aceton elegyből kicsapjuk. Az eljárással 1,72 g tisztított, védett Leu 12—Thr 27 —kalcitonin M-et kapunk. 30 DS: Rf (52A)=0,33; Rf(100) = 0,30; Rj<107) = 0,58. 8. példa H—Cys—Gly—Asn—Leu—Ser—Thr—Cys—Met— —Leu—Gly—Thr—Leu—Thr—Gin—Asp—Phe— —Asn—Lys—Phe—His—Thr—Phe—Pro—Gin— —Thr—Asn—Thr—Gly—Val—Gly—Ala—Pro— 40 —NH2—acetát (Leu12 —Asn26—Thr 27 —kalcitonin M acetát) 170 mg Boc—Cys—Gly—Asn—Leu—Ser(tBu)—Thr-45 -(tBu)—Cys—Met—Leu—Gly—Thr(tBu)—Leu—Thr-(tBu)—Gin—Asp(OtBu)—Phe—Asn—Lys(Boc)— —Phe—His—Thr(tBu)—Phe—Pro—Gin—Thr(tBu)— —Asn—Thr(tBu)—Gly—Val—Gly—Ala—Pro—NH2-t 5 ml 90%-os trifiuor-ecetsavban oldunk, az oldatot 90 50 percig 25 °C hőmérsékleten állni hagyjuk, a képződött peptid-trifluor-acetátot peroxidmentes éterrel kicsapjuk, a csapadékot leszűrjük, éterrel mossuk, szárítjuk és ezután 1%-os ecetsavban oldjuk. Az oldatot Merckféle ioncserélő (gyengén bázikus, acetátforma) gyantá-55 val töltött oszlopon szűrjük, 1%-os ecetsavval eluáljuk és az eluátumot liofilizáljuk (116 mg). Tisztítás céljából a kapott acetátot 5 ml vízben oldjuk (az oldat pH-ja 4,2) és keverés közben részletekben, összesen 2,8 ml Merck-féle ioncserélő II. sz. (gyengén bázikus, bázis-60 forma) gyantát adunk hozzá. Az oldat pH-ja lassan emelkedik és körülbelül 6,7 pH értéknél a szabad pepiid kicsapódása megkezdődik. Az elegyet 2 óra hosszat keverjük, miközben a pH-értéke 7,l-re emelkedik. A csapadékot ezután az ioncserélő gyantával együtt le-65 szűrjük, vízzel mossuk és a peptid gyantáról történő 14
