171243. lajstromszámú szabadalom • Eljárás új dotriakontapeptidamidok előállítására
21 171243 22 h) Bmp—Gly—Asn—Leu—Ser(tBu)—Thr(tBu)— —Cys—Met—Leu—Gly—Lys(Boc)—Leu—Thr(tBu)— Gin—Asp(OtBu)—Leu—Asn—Lys(Boc)—Leu—His— —Thr(tBu)—Tyr(tBu)—Pro—Gin—Thr(tBu)—Asn— —Thr(tBu)—Gly—Val—Gly—Ala—Pro—NH2 43 mg Bmp—Gly—Asn—Leu—Ser(tBu)—Thr(tBu)— —Cys—Met—Leu—Gly—OH (2 050 454 számú német szövetségi köztársaságbeli nyilvánosságra hozatali irat), az előbbi eljárás szerint hidrogénezett 80 mg dokozapeptid, 7,5 mg N-hidroxi-szukcinimid és 10 mg diciklohexil-karbodiimid 0,6 ml dimetil-formamidban elkészített oldatát nitrogénatmoszférában, 3 1/2 óra hosszat, 45 °C hőmérsékleten keverjük. A nyers terméket ezután 15 ml éter hozzáadásával kicsapjuk és Craig-extrakcióval metanol, puffer, kloroform, szén-tetraklorid 11:3: :6:7 rendszerben (puffer az 1. példa k) eljárásában megadott), több mint 200 szakaszban, egyenként 3 ml fázistérfogattal tisztítjuk. A tiszta anyagot szokásos módon a 90—115 számú frakciókból (rmax=100; K= 1,0) mint amorf port különítjük el. DS: Rf(52)=0,27; Rf(70)=0,66; Rf(100) = 0,31. 5. példa H—Cys—Gly—Asn—Leu—Ser—Thr—Cys—Met— —Leu—Gly—Lys—Leu—Thr—Gin—Asp—Leu— —Asn—Lys—Leu—His—Thr—Tyr—Pro—Gin— —Thr—Asn—Thr—Gly—Val—Gly—Ala—Pro— —NH2—hidroklorid, (Lys11 —Leu12-16 -19 —Tyr22—Asn 26 —Thr 27 —kalcitonin M hidroklorid) 50 mg Boc—Cys—Gly—Asn—Leu—Ser(tBu)—Thr--(tBu)—Cys—Met—Leu—Gly—Lys(Boc)—Leu—Thr-(tBu)—Gin—Asp(OtBu)—Leu—Asn—Lys(Boc)— —Leu—His—Thr(tBu)—Tyr(tBu)—Pro—Gin—Thr-(tBu)—Asn—Thr(tBu)—Gly—Val—Gly—Ala—Pro— —NH2-t az 1. példában leírt eljárás szerint 12 n sósavoldattal 0 °C hőmérsékleten kezelve szabad peptiddé alakítunk. DC: R f(45)=0,43; Rj<101A)=0,43; Rf (112E)=0,38 Vékonyréteg-elektroforézis: pH 1,9; 16 volt/cm; 1 1/2 óra; futási távolság a katódhoz körülbelül 4,9 cm. A védett dotriakontapeptidamidot a következő módon állítjuk elő: 110 mg Boc—Cys—Gly—Asn—Leu—Ser(tBu)— —Thr(tBu)—Cys—Met—Leu—Gly—OH-t [Helv. 53, 556 (1970)], 185 mg H—Lys(Boc)—Leu—Thr(tBu)— —Gin—Asp(OtBu)—Leu—Asn—Lys(Boc)—Leu— —His—Thr(tBu)—Tyr(tBu)—Pro—Gin—Thr(tBu)— —Asn—Thr(tBu)—Gly—Val—Gly—Ala—Pro—NH2-t (4. példa g) eljárása) és 17,2 mg N-hidroxi-szukcinimidet melegítés közben 1,5 ml dimetil-formamidban oldunk, 23 mg diciklohexil-karbodiimidet adunk hozzá és nitrogénáramban 3 1/2 óra hosszat, 45 °C hőmérsékleten keverünk. A nyers terméket ezután 30 ml peroxidmentes éter hozzáadásával kicsapjuk és Craig-extrakcióval metanol, puffer, kloroform, szén-tetraklorid 11:3:6:7 rendszerben (puffer az 1. példa k) eljárásában megadott), több mint 350 szakaszban tisztítjuk. 5 A kromatográfiailag tiszta, védett dotriakontapeptidet a 140—179 számú frakcióból (rmax =159; K = 0,83) szárazra történő bepárlással és a puffer nagyvákuumban 45 °C-on történő kiszublimálásával különítjük el. DS: Rf(52A)=0,28; Rf(70) = 0,54; Rf<100) = 0,29. 10 6. példa H—Cys—Gly—Asn—Leu—Ser—Thr—Cys—Met— 15 —Leu—Gly—Thr—Tyr—Thr—Gin—Asp—Phe— —Asn—Lys—Phe—His—Thr—Phe—Pro—Gin— —Thr—Ala—Thr—Gly—Val—Gly—Ala—Pro— —NH2—acetát (Thr 27 —kalcitonin M acetát) 20 202 mg Boc—Cys—Gly—Asn—Leu—Ser(tBu)— —Thr(tBu)—Cys—Met—Leu—Gly—Thr(tBu)—Tyr-(tBu)—Thr(tBu)—Gin—Asp(OtBu)—Phe—Asn—Lys-(Boc)—Phe—His—Thr(tBu)—Phe—Pro—Gin—Thr-25 -(tBu)—Ala—Thr(tBu)—Gly—Val—Gly—Ala—Pro— —NH2-t 6 ml 90%-os trifluor-ecetsavban oldunk, nitrogéngázzal átöblítjük és 90 percig 23 °C hőmérsékleten állni hagyjuk. A reakcióelegyet ezután 50 ml jéggel hűtött, peroxidmentes éterre öntjük, a csapadékot le-30 szűrjük, éterrel mossuk és vákuumban 40 °C hőmérsékleten szárítjuk. A kapott 185 mg Thr27 —kalcitonin M trifluor-acetátot Merck-féle ioncserélő II. sz. (gyengén bázisos, acetátforma) gyantával töltött oszlopon eluálva acetáttá alakítjuk. A liofilizált acetát kiterme-35 lése 158 mg. A tisztításhoz 80 mg acetátot 5 ml vízben oldunk, keverés közben összesen 1,2 ml Merck-féle ioncserélő II. sz. (gyengén bázikus, szabad bázisforma) gyantát adunk hozzá, mellyel a-pH körülbelül 6,5-re áll be, és 40 finom csapadék válik ki. A csapadékkiválás teljessé tételére az elegyet 2 óra hosszat keverjük, miközben az oldat pH-ja 7,l-re emelkedik. A csapadékot és az ioncserélőt ezután leszűrjük, vízzel jól kimossuk és az ioncserélőről a kicsapódott pep-45 tidet 90%-os ecetsav hozzáadásával leoldjuk. Az ioncserélőt leszűrjük, 90%-os ecetsavval mossuk és az ecetsavas oldatot liofilizáljuk. A 74 mg Thr27 -kalcitonin M-t mint ecetsavas sót kapjuk, mely vékonyréteg-kromatografálás és elektroforézis után igen nagy tisztasá-50 got mutat. DA: Rf(52)=0,49 [kalcitonin M: R f(52)=0,55] DC: Rj(101A)=0,52 [kalcitonin M: Rf(101A)=0,57]. Vékonyréteg-elektroforézis cellulózlemezen: pH 1,9; 55 2 óra; 280 volt; futási távolság a katódhoz 4,5 cm (kalcitonin M: futási távolság 4,5 cm). Aminosavanalízisnél totálhidrolízissel (6 n sósav-oldat, 110 °C, 24 óra) a termék számított aminosavarányt mutat. 60 A kiindulási anyagot a következő módon állítjuk elő: a) Z—Ala—Thr(tBu)—Gly—OMe 18,9 g Z—Ala—ONp, 13,4 g H—Thr(tBu)—Gly— 65 —OMe—hidroklorid, 100 ml dimetil-formamid és 6.2 II
