171216. lajstromszámú szabadalom • Eljárás szacharáz-inhibitorok előállítására

5 171216 6 koholokkal vagy vizes acetonnal frakcionált deszorpciót végzünk. Ha a hidrolizátum sötét színű, akkor az adszorpciós művelet előtt az oldatot savanyú pH-értéknél (pH = 1—3) aktív szénnel derítjük. A találmány szerinti eljárással előállítható legjobb inhibitorpreparátumok inhibitor-aktivitása 15 000 SIE/g. A találmány szerinti hasítást enzimatikus úton is megvalósíthatjuk, erre a célra legelőnyösebben ß-amilazt alkalmazunk. Ismeretes, hogy embereknél és állatoknál szacharóztartalmú élelmiszerek és élvezeti cikkek fogyasztása után hiperglikémia lép fel. A hiperglikémia oka az, hogy az emésztési traktusban található szacharáz enzim a szacharózt az alábbi egyenlet szerint szacharáz , szacharóz * glükóz + fruktoz gyorsan elbontja. Az így fellépő hiperglikémia cukorbetegeknél különösen erős és tartós. A táplálkozás következtében fellépő hiperglikémia adipozitásban szenvedő betegeknél különösen erős inzulinszekréciót vált ki, ez pedig túlzott zsírfelvételt és csökkentett zsírleadást eredményez. A találmány tárgya eljárás új szacharáz-inhibitorok előállítására és elkülönítésére. A találmány szerinti eljárással előállított és elkülönített szachazár-inhibitorok jelentősen csökkentik a patkányok szacharóz-terhelés után mérhető hiperglikémiáját és hiperinzulinémiáját. Ismeretes az is, hogy szacharóz-tartalmú élelmiszerek és élvezeti cikkek fogyasztása után különösen gyakran és erősen lép fel fogszuvasodás [1. pl. B. W. Old: Advances in Applied Microbiology, 11 135—157 (1969)]. A találmány szerinti eljárással előállított és elkülönített szacharáz-inhibitorok a fogszuvasodást kiváltó anyagok képződését is csökkentik a szájüregben. A találmány szerinti inhibitorokat tehát az alábbi kórok és kóros állapotok kezelésére alkalmazhatjuk: adipozitás, hiperlipémia, ateroszklerózis, cukorbaj, cukorbaj előtti állapotok, fogszuvasodás. A találmány szerinti eljárással előállított szacharázinhibitorokat tabletták, drazsék, kapszulák, oldatok, szuszpenziók, granulátumok formájában juttathatjuk a szervezetbe, de adott esetben rágógumihoz, fogpasztához vagy szacharóztartalmú élelmiszerekhez és/vagy élvezeti szerekhez adhatjuk. A találmány szerinti eljárást a továbbiakban — az oltalmi kör korlátozása nélkül — példák segítségével mutatjuk be. 1. példa 5 g, az SE 50 Actinoplanacea törzs (CBS-szám: 961.70) által termelt amiláz-inhibitort (aktivitás: 10.106 AIE/g, 220 SIE/g) feloldunk 50 ml 4,5 pH-jú 0,05 m nátriumacetát-pufferben, majd 25 mg árpából elkülönített ß-amilazt (gyártja a Sewa cég, Heidelberg, NSZK; megrendelési szám: 13 440) adunk az oldathoz és azt 35 C°-on inkubáljuk. 3 órás inkubálás után — a hasítás befejeződtével — a reakcióelegyet keverés közben 450 ml alkoholba csepegtetjük, a kivált fehér pelyhes csapadékot leszívatjuk, etanollal és éterrel kétszer mossuk és vákuumban megszárítjuk. Hozam: 2,5 g 4,6.106

AIE/g és 700 SIE/g aktivitású termék. A kiindulási amiláz-inhibitort az SE 50 Actinoplanacea törzzsel az alábbiak szerint állítjuk elő: 5 5 fermentort, amelyek mindegyike 8 liter táptalajt (2% keményítő, 1% glükóz, 0,5% NZ-amin, 1,0% élesztőextraktum, és 0,4% CaC03

121 C°-on 30 percig sterilizálva, sterilizálás előtt a pH érték 7,2-re beállítva) 10 és 0,02 térf.% Bayer Silicon E jelű habzásgátlót tartalmaz, beoltunk az SE 50 Actinoplanacea törzs (CBS 961.70) az előbbivel azonos összetételű táptalajon zabpehelyagar ferde kultúrából beoltva készített előkultúrájának 120 ml-ével. A beoltás után a tápoldatot keverés 15 és levegőztetés közben 65 órán át inkubáljuk 28 C° hőmérsékleten, azután egyesítjük és a micéliumot centrifugálással elválasztjuk. A centrifugált tenyészoldatot vákuumban 20 torr nyomáson és 100 C° fürdőhőmérsékleten 1,2 liter térfogatra bepároljuk. A fekete színű 20 oldatot összekeverjük azonos térfogatú (1,2 liter) metanollal. Ekkor pelyhes fekete csapadék képződik. A csapadékot redős szűrőn átszűrjük, és a 2,2 liter térfogatú barna szűrletet intenzív keverés közben becsepegtetjük 10 liter abszolút etanolba. Világos barna színű csapadék 25 képződik, amelyet kiszűrünk, acetonnal és éterrel mosunk és vákuumban megszárítunk. 185 g világos okkersárga port kapunk, amelynek aktivitása 3700 AIE/mg. További tisztítás céljából a teljes csapadékmennyiséget (185 g) feloldjuk 250 ml vízben és a sötétbarna színű 30 oldatot acetát formájú Amberlite IRA 410 ioncserélő gyantával (pH = 7) töltött 5X75 cm méretű oszlopra visszük fel. Eluálószerként vizet használunk. Az első 500 ml eluátumot eldobjuk, a következő 5000 ml térfogatú csaknem színtelen eluátum tartalmazza az inhibi-35 tort. Ezt rotációs bepárlóban 200 ml térfogatra bepároljuk, 2 liter abszolút etanolba csepegtetjük, a csapadékot kiszűrjük, etanollal és éterrel mossuk, majd vákuumban szárítjuk. 80 g fehér színű port kapunk, amelynek aktivitása 8000 AIE/mg. 2. példa 100 g, az SE 50 törzs által előállított amiláz-inhibitort 45 feloldunk 500 ml 2 kénsavban, majd az elegyet 4 órán keresztül 100 C°-on tartjuk. A kapott sötét színű oldat pH-ját lehűtés után 10 n káliumhidroxid-oldattal 2,0-ra állítjuk be, 4 g aktív szenet adunk hozzá, 10 percig keverjük, a szenet leszívatjuk, majd a derítési műveletet 50 megismételjük. A világos sárga színű szűrletet 10 n káliumhidroxid-oldattal pH 6,6-ig semlegesítjük, majd az inhibitor-hatású anyagok adszorbeálására 20 g aktív szenet adunk az oldathoz. Az elegyet 10 percen keresztül keverjük, szűrjük és a szűrletet további 10 g aktív szénen 55 adszorbeáljuk. A szénfrakciókat egyesítjük, a szűrletet elöntjük. Az aktív szenet a maradék só és glükóz eltávolítására a szűrőn 2 liter desztillált vízben és 2 liter 2,5%-os etanolban szuszpendáljuk, majd 3 X 750 ml 10%-os etanollal és 3X750 ml 15%-os etanollal az 60 inhibitort lemossuk az aktív szénről. A deszorpciót úgy végezzük, hogy az oldószer megadott részletében az aktív szenet 10 percen keresztül keverjük, majd az elegyet leszívatjuk. A 10%-os és a 15%-os etanolos frakciókat külön-külön egyesítjük, forgólombikos bepároló-65 ban kb. 20 ml térfogatra bepároljuk és liofilizáljuk. 3