171216. lajstromszámú szabadalom • Eljárás szacharáz-inhibitorok előállítására
7 171216 8 Hozam: kb. 2 g a 10%-os etanolos frakcióból és 1,2 g a 15%-os frakcióból. Aktivitás: 10%-os etanolos frakció: 9000 SIE/g, 0,2.106 AIE/g 15%-os etanolos frakció: 15 000 SIE/g, 0,5.106 AIE/g 3. példa 200 mg, az SE 82 törzs (CSB-szám: 615 71) tenyészetéből elkülönített amiláz-inhibitort (aktivitás: 6.106 AIE/g, 160 160 SIE/g) feloldunk 10 ml 0,75 n sósavban. Az így kapott oldat aktivitása 120.106 AIE/liter és 3200 SIE/liter. Az oldatot 30 percen keresztül 100 C°-on inkubáljuk, majd lehűtjük és megállapítjuk aktivitását. Az oldat amiláz-inhibitor aktivitása 8.106 AIE/liter, szacharáz^inhibitor aktivitása 21 000 SIE/liter. A kiindulási amiláz-inhibitort az SE 82 Actinoplanacea törzzsel (CBS 615.71) az alábbiak szerint állítjuk elő: 1 literes Erlenmeyer-lombikba 4% keményítőt, 2,4% glükózt, 0,9% NZ-amint és 0,9% élesztőextraktumot tartalmazó, nátriumhidroxiddal pH 7,6-re beállított és 0,4% CaC03 -tal összekevert és 121 C°-on 30 percig sterilizált tápoldat 120 ml-ét töltjük be. A tápoldatot beoltjuk az SE 82 törzs előtenyészetének 3 ml-ével. Az előkultúrát 2% keményítőt, 1% glükózt, 0,5% NZ-amint és 1 % élesztőextraktumot tartalmazó, NaOH-dal pH 7,2-re beállított, 0,4% CaC03 -tal összekevert és 121 C°-on 30 percig sterilizált táptalajon állítottuk elő. A beoltás után a tenyészetet 5 napig tenyésztjük rázógépben 28 C° hőmérsékleten. 122 000 AIE/ml aktivitású tenyészoldatot kapunk. A micéliumot az egyesített tenyészoldatokból percenként 12 000 fordulatszámú centrifugán különítjük el, azután a szűrlet pH-ját 1 : 1 hígítású HN03 -mal 2,5-re állítjuk be, majd az oldatot 2,5 g analitikai tisztaságú aktív szénnel 10 percig keverjük. Az aktív szén percenként 12 000 fordulatszámú centrifugán való elválasztása után az oldat pH-ját 10 n KOH-val 6-ra állítjuk be. Az oldathoz 300 ml metanolt adunk, rövid ideig állni hagyjuk, azután a csapadékot percenként 12 000 fordulatszámú centrifugán elkülönítjük. A felülúszó részt 3 liter etanolba csepegtetjük, majd az így kapott csapadékot rövid ideig való állás után percenként 12 000 fordulatszámú centrifugán elkülönítjük. A csapadékot kétszer mossuk abszolút etanollal, majd egyszer éterrel, azután vákuumban megszárítjuk. 2,23 g terméket kapunk, amelynek aktivitása 7,45.106 AIE/g. A termék az aminocukor-származékok magasabb homológjaiból (n >• 3) 95%-nál többet tartalmaz. 4. példa 200 mg, az SB 18 Actinoplanacea törzs (CBS-szám: 957.70) tenyészetéből elkülönített amiláz-inhibitort (aktivitás: 4.106 AIE/g, 310 SIE/g) feloldunk 10 ml 0,75 n sósavban. Az így készített oldat aktivitása 80.106 AIE/liter, illetve 6200 SIE/liter. Az oldatot 30 percen keresztül 100 C°-on vízfürdőn inkubáljuk, majd lehűtjük és megállapítjuk aktivitását. Az oldat amiláz-inhibitor aktivitása 10.106 AIE/liter, szacharáz-inhibitor aktivitása 28 000 SIE/liter. 5 A kiindulási amiláz-inhibitort az SB 18 Actinoplanacea törzzsel (CBS 957.70) az alábbiak szerint állítottuk elő: 2% keményítőt, 1% glükózt, 0,5% NZ-amint, 1,0% 10 élesztőextraktumot és 0,4% kalciumkarbonátot tartalmazó, pH 7,2-re beállított, majd 121 C°-on 30 percig sterilizált táptalajt beoltunk az SB törzs előkultúrájának 2 ml-ével. (Az előkultúrát az előbbivel azonos táptalajon, zabpehelyagar ferde kultúrából állítottuk elő.) 15 A beoltott táptalajt 3 napon keresztül 28 C°-on inkubáljuk. 1100 AIE/ml aktivitású tenyészoldatot kapunk. A tenyészoldatból centrifugálással elkülönítjük a micéliumot, azután az oldatot vákuumban 200 torr nyo-20 máson és 100 C° fürdőhőmérsékleten 1,2 liter térfogatra bepároljuk. A sötét színű oldatot összekeverjük azonos térfogatú (1,2 liter) metanollal. Pelyhes, fekete csapadék képződik, amelyet redős szűrőn szűrünk. A barna színű szűrletet intenzív keverés közben 10 liter abszolút etanol-25 ba csepegtetjük. Világosbarna színű csapadék képződik, amelyet kiszűrünk, acetonnal és éterrel mosunk és vákuumban szárítunk. 185 g világosbarna port kapunk, amelynek aktivitása 3700 AIE/mg. Az előbbi terméket 250 ml vízben oldjuk, és az oldatot 30 acetát formájú Amberlite 410 ioncserélő gyantával (pH = 7) töltött 5X75 cm méretű oszlopra visszük fel. Az eluálást vízzel végezzük. Az első 500 ml eluátumot eldobjuk, a következő 5000 ml csaknem színtelen eluátum tartalmazza az inhibitort. Az utóbbi eluátumot forgó 35 bepárlóban 200 ml térfogatra pároljuk be, és a betöményített oldatot 2 liter abszolút etanolba csepegtetjük. A kapott csapadékot kiszűrjük, etanollal és éterrel mossuk, és vákuumban megszárítjuk. 80 g fehér port kapunk, amelynek aktivitása 8000 AIE/mg. 5. példa A 2. példa szerint előállított hatóanyag hatásosságát 45 patkányokon szacharóz-terhelési vizsgálattal az alábbiak szerint ellenőriztük: Patkányok egy csoportjának (6 db állatnak) hiperglikémia és hiperinzulinémia kiváltására szénhidráttal történt táplálás után orálisan 2,5 g/kg szacharózt adunk be 50 oldat formájában. Szintén hat állatból álló patkánycsoportot a hiperglikémia és a hiperinzulinémia csökkentésére a szacharóz-adagolás után orálisan a 2. példa szerint előállított hatóanyaggal kezeltünk, majd a táblázatban feltüntetett időpontokban a kezelt és kontroll-55 csoportban meghatároztuk az állatok vércukor- és széruminzulin-szintjét. A redukáló cukrokat Hoffman eljárásával (J. Biol. Chem. 120, 51, 1937) a Technicon cég által előállított Auto-analyzer készülék segítségével határoztuk meg, az inzulin meghatározása Hales és 60 Randié módszerével (Biochem, J. 88, 137, 1963) történt. A vizsgálathoz a vért a patkányok retroorbitális vénaplexusából vettük. A vizsgálatok eredményeit (középértékek, méréshatá-65 rok) az alábbi táblázatban tüntettük fel. 4
