171199. lajstromszámú szabadalom • Eljárás 2-amino-4-hidroxi -7,8-dihidro-pteridinek előállítására
17 171199 18 Amint az 1. táblázat adataiból megállapítható, az 1—9. sz. kémcsövek mindegyike tartalmaz HMPPS-forrást, jelzett ATP-t és 0,02 mólos MgCl2 .6H 2 0 oldatot. A 2—9. sz. kémcsövek ezen felül HMPt-t, míg a 4—9. sz. kémcsövek vizsgálandó vegyületet is tartalmaznak. 5 A 10—12. sz. kontrollkémcsövek HMPPS- és szintetázforrást, jelzetlen ATP-t, 0,1 mólos MgCl2 .6H 2 0 oldatot és jelzett pAB-t tartalmaznak. Az 1—9. sz. kémcsövekben levő elegyek térfogatát desztillált vízzel 200 [Jil-re egészítjük ki, az elegyeket 10 60 percig 37 C°-on inkubáljuk, majd jéggel hűtjük. Az egyes oldatokhoz 20 [ú 72,1 mg/ml koncentrációjú dextróz-oldatot és 5 (xl 2000 egység/ml koncentrációjú hexokináz-oldatot adunk, és az elegyeket 15 percig szobahőmérsékleten állni hagyjuk. Az egyes kémcső- 15 vekhez ezután 10—10 mg Darco—G—60 kereskedelmi nevű csontszenet adunk, az elegyeket időnként kevergetjük, majd 10 perc elteltével a csontszenet Millipore AP 250 2200 kereskedelmi nevű szűrőpapíron kiszűrjük, és 3 X 10 ml hideg vízzel mossuk. Ezután meghatá- 20 rozzuk a csontszén és a szűrlet radioaktivitását. A 2. és 3. sz. kémcsöveknél észlelt radioktivitást tekintettük maximális értéknek, ezek a kémcsövek ugyanis nem tartalmaztak (I) általános képletű vegyületet, így az enzimgátló hatás ezekben az elegyekben 25 0%. A további kísérletekben észlelhető %-os enzimgátló hatást az észlelt és a maximális radioaktivitás hányadosából számítjuk ki. A 10—12. sz. kémcsövek tartalmát a (b) pontban ismertetésre kerülő kromatográfiás módszerrel elemez- 30 zük, és kontrollként használjuk. A 10. és 11. sz. kémcsöveknél észlelt adatokat 100%-nak tekintjük, ezek a kémcsövek ugyanis nem tartalmaztak (I) általános képletű vegyületet, következésképpen az ezekben jelentkező enzimgátlás értéke 0%. A (b) pontban ismerte- 35 tésre kerülő módon kezelt elegyekben fellépő enzimgátló hatást a fenti és az észlelt kromatográfiás adatok összehasonlításából számítjuk ki. (b) Az (I) általános képletű vegyületek szintetázgátló hatását a dihidropteroát-C14 képződésének méré- 40 sével vizsgáljuk. 50 \ú 0,1 mólos semlegesített ATP oldatból, 50 [j.1 0,1 mólos MgCl2 .6H 2 0 oldatból, 100 \x\ 0,1 mólos ditiotreit-oldatból, 100 yA 0,4 mólos trisz-pufferoldatból (pH = 8,3), 25 [xl 876 [xmól koncentrációjú HMPt oldat- 45 ból és 170 [j.1 HMPPS-oldatból „Pt-elegyet" készítünk. Az elegyet 60 percig 37 C°-on inkubáljuk, rövid ideig jéggel hűtjük, majd az oldathoz szobahőmérsékleten 100 \ú 72,1 mg/ml koncentrációjú dextrózoldatot és 20 \xl 2000 egység/ml koncentrációjú hexokinázoldatot 50 adunk. Az elegyet 15 percig szobahőmérsékleten állni hagyjuk. 5-5 kémcsőbe egyenként 10 yA 0,1 mólos MgCl2 . 6H2 0 oldatot, 10 [xl 0,4 mmól koncentrációjú pAB-C 14 oldatot, 20 jxl 0,1 mólos ditiotreit-oldatot és 20 jxl 55 0,4 mólos trisz-pufferoldatot (pH =8,3) töltünk, majd az egyes kémcsövekhez 80-80 [xl fenti módon készített „Pt-elegyet" adunk, a 2. táblázatban felsorolt mennyiségű szintetázzal és (I) általános képletű vizsgálandó vegyülettel együtt. 60 A kontrollkísérletekhez két kémcsövet használunk fel. Mindegyik kémcsőbe 10 [xl 0,1 mólos ATP-oldatot, 10 fxl 0,1 mólos MgCl2 .6H 2 0 oldatot, 20 [xl 0,1 mólos ditiotreitoldatot, 20 [xl 0,4 mólos trisz-pufferoldatot (pH = 8,3) 10 [xl 0,4 mmól koncentrációjú pAB-C14 65 oldatot és 20 \ú ismert aktivitású, HMPPS-t és szintetázt tartalmazó oldatot töltünk. A kémcsövek közül a másodikhoz vizsgálandó vegyületet adunk, (a vizsgálandó vegyület végső koncentrációja: 10~5 mól), majd mindkét kémcső tartalmát desztillált vízzel 200 [xl-re egészítjük ki. 2. táblázat Kémcső száma Szintetázfölösleg Vizsgálandó vegyület végső koncentrációja í 2 3 4 5 + + + + 8,7 X 10~5 mól 1,0 X 10~5 mól 2,5 X 10~6 mól Kontroll 6 7 1,0 X 10~5 mól Mind a hét kémcső tartalmát 30 percig 37 C°-on inkubáljuk, jéggel hűtjük, majd a kémcsövek tartalmát az (a) pontban ismertetett 10—12. sz. kémcsövek tartalmával együtt kromatográfiás elemzésnek vetjük alá. Az elemzést a következőképpen végezzük: Az egyes kémcsövekből 100-100 [xl folyadékot különítünk el, és a folyadékot 2 X 20 cm méretű Whatman No. 3MM kromatográfiás papír alapvonalára cseppentjük. 0,1 mólos Sorenson-pufferoldattal (kálium- és nátrium-foszfát, pH = 7,0) leszálló kromatografálást végzünk, 10—15 cm távolságig. Az egyes kémcsövekből elkülönített folyadékok kromatografálásakor kapott foltok viszonylagos helyzetéből kiszámítjuk a %-os szintetázgátlást. Viszonyítási alapként a 10. és 11. sz. kémcsöveknél észlelt adatokat használjuk. Az utóbbi kémcsövekben az enzimgátlás mértéke 0"/o. A kombinációs készítmények előállításához, valamint az (I) általános képletű vegyületeket önmagában tartalmazó készítményekhez azokat a hatóanyagokat használjuk fel, amelyek a fenti kísérletben 100 jxmólos vagy kisebb koncentrációban mutatnak 50%-os gátló hatást, és toxicitásuk megfelelően kis érték. A fenti kísérletben a 2-amino-4-hidroxi-6-hidroximetil-7,7-dietil-7,8-dihidro-pteridin 2,1 [xmól koncentrációban fejt ki 50%-os gátló hatást. 4. példa E kísérletben a 2-amino-4-hidroxi 6-hidroximetil-7,7-dietil-7,8-dihidro-pteridint trimetoprimmal (TMP) és/vagy szulfametoxazollal (SMX) elegyítve taitalmazó készítmények esetén fellépő szinergetikus hatásfokozódá's mértékét vizsgáljuk. Vizsgálati mikroorganizmusként Staphylococcus aureust használunk. A pteridin-vegyületet kis timidintartalmú szója-pepton táptalajjal (Wellcotest Sensitivity test agar) keverjük össze. A táptalajt Petri-csészébe töltjük, a táptalajból egy kis rögöt eltávolítunk, és az így kialakult üregbe helyezzük a további komponenst vagy komponenseket. A táptalaj felületét beoltjuk a vizsgálati mikroorganizmussal, majd a rendszert inkubáljuk. A gátlás mértékét 9
