171026. lajstromszámú szabadalom • Eljárás antibiotikum-keverék előállítására

5 171026 6 esetből háromszor feltisztítja, és 21 nap után sárga-krémszínű oldódó színanyag figyelhető meg. Az A. auranticolor ATCC 31 011 a glükózt, arabinózt, fruktózt, mannitot, ramnózt, szacharózt és xilózt hasznosítja. Az A. auranticolor ATCC 15 330 5 mindegyiket hasznosítja a fentiek közül, a raffinóz kivételével. A két törzs spóratartói és spórái hasonlóak, az A. auranticolor 15 330 spórái pálcika alakúak. A legfontossabb, különösen és az hogy az A. 10 auranticolor ATCC 15 330 ezen fermentációs körülmények között, ahol az A. auranticolor ATCC 31 011 a találmány szerinti antibiotikum-keveréket termeli, semmiféle antibiotikus hatású anyagot nem szintetizál. 15 A találmány szerinti eljárás egy előnyös kivitelezési változata szerint az A. auranticolor ATCC 31 011 tenyésztését vizes táptalajon, 28 C° és 36 C° közötti hőmérsékleten, süllyesztett, levegőztetett fermentációs körülmények között, keverés közben végezzük. 20 Táptalajösszetevőként szénforrást, például cukrokat, mint például keményítőt vagy melaszt, szerves nitrogénforrást, például kazeint, enzimesen hidrolizált kazeint, szójalisztet, gyapotmaglisztet, földimogyorólisztet és búzasikért használunk. Növekedési anya- 25 gokat tartalmazó adalékként desztillátumokat, hallisztet vagy élesztőid vonatot, továbbá sókat, például nátriumkloridot, kalciumkarbonátot, nyomelemekre, például vas- magnézium-, cink-, kobalt-, és mangánionokra disszociáló sókat szintén jó eredménnyel 30 adagolhatunk a táptalajhoz. A fermentáció során habzás léphet fel, ebben az esetben habzásgátlókat, például növényi olajokat vagy szilikonokat adunk a tenyészléhez. A táptalajon előnyösen a táptalaj térfogatára számítva 0,5 és 2 35 közötti térfogatú levegőt vezetünk át percenként. A keverést a fermentációs iparban szokásos módon, ismert keverőkkel végezzük. A táptalajt természetesen steril körülmények között oltjuk, és sterilen végezzük a tenyésztést. 40 Az antibiotikum-keverék előállítására az ínokulumot például ATCC Medium 172 (lásd előbb) táptalajból készített ferdeagarról oltjuk. A ferdeagarról vagy rázott tenyészetet, vagy inokulum-fermentort oltunk, de eljárhatunk úgy is, hogy rázott 45 tenyészettel oltjuk az inokulum-fermentort. Rázott tenyészetben a mikroorganizmus általában körülbelül a 4. napon éri el a maximális növekedést, míg tankfermentorban a süllyesztett inokolum általában a 2. és 3. nap között éri ei az előnyös kort. 50 A főfermentorban körülbelül a 20. és 30. óra között jelentős antibiotikus aktivitás mérhető. A fermentáció során az antibiotikum-termelést egy érzékeny Staphylococcus aureus-szal szemben végzett biológiai értékméréssel ellenőrizzük. Erre a 55 standard agardiffuziós mérést használjuk, amelynek során a tenyészlé antibiotikum-tartalmát egy, a tenyészlével telített szűrőpapír-korong körül kialakult gátlási zónával mérjük. Amikor a tenyészlé antibiotikum-tartalma eléri a 60 kívánt értéket, a terméket vagy a teljes tény észléből, vagy annak szűrletéből különítjük el. Az utóbbi esetben a micéliumot szűréssel vagy centriíugálással elkülönítjük. Ilyenkor különböző eszközöket, például nyomószűrőt, centrifugákat stb. használhatunk. 65 A tenyészlében megjelenő antibiotikum-keverék és a tenyészléből elkülönített nyers és tisztított termékek analízisére előnyösen használhatjuk a szilikagéllel kivitelezett vékonyrétegkromatográfiát. Az antibiotikum-keverék összetevőinek szétválása jelentősen függ a felcseppentett antohiotikum mennyiségétől. Túl kevés antibiotikum jelenlétekor nem válnak láthatóvá a kísérő antibiotikum-komponensek, ha túl sok antibiotikumot cseppentünk fel, a foltok összefolynak, és így gyenge a feloldás. A vékonyrétegkromatográfia során futtatóelegyként kloroform és etanol 9 :1 arányú elegyét használjuk. A vékonyrétegkromatogramot a futtatás után 254 mß és 366 m/u hullámhossúságú ultraibolya fényben láthatjuk. Az antibiotikum-keverék összetevőinek bioatuográfiás előhívását úgy végezzük, hogy érzékeny Staphylococcus aureus-szal, vagy más érzékeny mikroorganizmussal beoltott tápagarral fedjük a szilikagélt. Az A, auranticolor ATCC 31 011 törzs elsődlegesen termelt antibiotikum-keverékében több makrociklusos lakton- és depszipeptid-típusú antibiotikum van. Ezen antibiotikum-összetevők jelenléte vagy hiánya, vagy százalékos mennyisége a termékben változik az egyes fermentációk során, függ az időtől, pH-tól, a táptalaj összetételétől stb. A későbbiekben ismertetett példákban megadott körülmények között az antibiotikum-komplex legfőbb összetevői a 37 277 (depszipeptid) és a 36 926 (makrociklusos lakton) jelű vegyület, míg a kísérő antibiotikum komponensek a 37 932 (depszipeptid) és a 35 763 (makrociklusos lakton) jelű vegyület. Az antibiotikum-keverék összetevőit egy sor különböző eljárással, többek között oldószeres extrakcióval, Craig-f, ellenáramú megoszlással, oszlopkromatográfiával, vagy ezek kombinációjával különíthetjük el a tenyészléből. Szerves oldószerként több oldószert, például kloroformot, etil-acetátot vagy metil-izobutil-ketont használhatunk, amikor az antibiotikumokat extraháljuk. Az oldószeres extrakciót előnyösen úgy végezzük, hogy az antibiotikumokat tartalmazó, feldolgozandó, 7 pH-jú tenyészlevet 1/3 és 1/2 közötti mennyiségű oldószerrel kétszer extraháljuk. A feldolgozandó tenyészlé térfogatától függően különböző eszközöket, például rázótölcséreket, keverővel felszerelt tartályokat és mechanikai extraháló eszközöket, például centrifuga-szeparátorokat használunk az extrakcióhoz. A találmány szerinti eljárás egy előnyös kivitelezési változata szerint az antibiotikum-komplex elkülönítésére és kinyerésére a következők szerint járunk el. A teljes vagy micéliummentes tenyészlé pH-ját 7-re állítjuk be, majd 1/3 és 1/2 térfogat közötti mennyiségű metil-izobutil-ketonnái kétszer extraháljuk. Csökkentett nyomáson töményítjük az oldószeres extraktumot, a sűrítményt heptánnal vagy petroléterrel kivitelezett extrakcióval zsírmentesítjük. A zsírtalanított, oldószeres sűrítményt ezután csökkentett nyomáson szárazra desztilláljuk. A desztillációs maradékként kapott szilárd halmazállapotú terméket Craig szerint ellenáramú megoszlással választjuk el (6 fázis), oldószerként 5 rész toluolból, 2 rész etanolból és 3 rész vizes, 4,5 pH-jú foszfát-pufferből álló elegyet használunk. Az elkülönült rétegek szolgáltatják az ellenáramú megosztás során a felső és 3