170890. lajstromszámú szabadalom • Eljárás új alfa-amino(5,6-dihidro-1,4-oxatiin- és -1,4-ditiin-2-il)-ecetsavak előállítására

170890 3. példa 4. példa 350 ml metanolban feloldunk 37 g DL-a-amino-(5,6--dihidro-l,4-oxatiin-2-il)-etilacetátot, majd hozzáadunk 182 ml n nátriumkarbonát-oldatot. A reakció keveréket 4°-on 3 óra hosszat állni hagyjuk, majd 20 Torr nyomáson térfogatának egyharmadára bepároljuk. A maradékot 5c-on

hűtve 4 n sósavval 4,5 pH-ra megsavanyítjuk, mire kristályos csapadék válik ki. 15 percnyi keverés után a csapadékot szűrőn elválasztjuk, és így fehér kristályok alakjában 19,4 g DL-a-amino-(5,6-dihidro-l,4--oxatiin-2-il)-ecetsavat kapunk. Olvadáspontja 270°. A DL-a-amino-(5,6-dihidro-1,4-oxatiin-2-il)-etilacetátot a következő módon állítjuk elő: 295 g a-hidroxiimino-(5,6-dihidro-l,4-oxatiin-2-il)-etilacetátot 1,5 liter metanolban oldunk, az oldathoz hozzáadunk 1,5 liter hangyasavat és 1,5 liter vizet. A reakciókeveréket jeges vízfürdőben hűtve, 30 perc alatt részletekben hozzáadunk 250 g cinkport. A hozzáadás befejezése után 20°-on 2 óra hosszat folytatjuk a keverést, majd a reakciókeveréket szűréssel elválasztjuk, és a szüredéket 20 Torr nyomáson 1 literre bepároljuk. A maradékhoz 1,5 liter vizet adunk, és összesen 3 liter etilacetáttal kétszer extraháljuk. A szerves kivonatokat kiontjuk, a vizes fázis pH-ját nátriumkarbonáttal 10-re állítjuk be, majd összesen 1,5 liter metilénkloriddal háromszor extraháljuk. Az így kapott szerves kivonatokat egyesítjük, nátriumszulfáton szárítjuk, aktív szénnel kezeljük, szűrjük, és 20 Torr nyomáson bepároljuk, mire olaj alakjában 150 g DL-a-amino-(5,6-dihidro-l,4-oxatiin-2-il)-etilacetátot kapunk. Az a-hidroxiimino-(5,6-dihidro-l,4-oxatin-2-il)-etilacetátot a következő módon állíthatjuk elő: 321 g 4-(2-hidroxi-etiltio)-2-hidroxiimino-3-oxo-etil-butirátot 3,2 liter forró toluolban oldunk, majd az oldathoz hozzáadunk 26 g p-toluolszulfonsav-monohidrátót, mire a reakciókeverékből élénk pezsgés közben víz szabadul fel. A vizet Dean—Stark készülék segítségével választjuk el, és a reakciókeveréket visszafolyatás közben 15 percig forraljuk. A reakciókeveréket lehűlés után szűréssel elválasztjuk, a szüredéket összesen 1,5 liter vízzel háromszor, majd 200 ml telített nátriumhidrogénkarbonát-oldattal és végül 500 ml vízzel mossuk. Magnéziumszulfáton szárítva, szűrve, és 20 Torr nyomáson bepárolva, száraz maradékként lassan megszilárduló olajként 273 g a-hidroxiimino-(5,6--dihidro-1,4-oxatiin-2-il)-etilacetátot kapunk. A 4-(2-hidroxi-etiltio)-2-hidroxiimino-3-oxo-etilbutirátot a következő módon állíthatjuk elő: 340 g 4-klór-2-hidroxiimino-3-oxo-etilbutirátot 1,5 liter kloroformban oldunk, és az oldathoz hozzáadunk 126 g 2-tio-etanolt. A kapott oldathoz 20°-on 30 perc alatt hozzáadjuk 248 ml trietilamin 1 liter kloroformmal készült oldatát. A reakciókeveréket 20°-on 15 percig keverjük, majd egymásután 200 ml vízzel, 200 ml 2 n sósavval és végül összesen 1 liter vízzel négyszer mossuk. A szerves fázist nátriumszulfáton szárítva, aktív szénnel kezelve, szűrve és 20 Torr nyomáson bepárolva, lassan megszilárduló olaj alakjában 321 g 4-(2--hidroxi-etiltio)-2-hidroxiimino-3-oxo-etilbutirátot kapunk. A megfelelő racém vegyületből enzimes bontással a következő módon állítunk elő 2 g L-«-amino-(5,6-dihidro-1,4-ditiin-2-il)-ecetsavat: a) „Amano" aciláz tisztítása A kereskedelemben kapható enzim titere 260 E/g, és legfontosabb szennyezésként proteázokat és festékanyagokat tartalmaz. Tisztítását 15 cm átmérőjű „Amicon" cellában Diaflo XM 50 membránon ultraszűréssel végezzük a következő módon: 15 g 260 E/g titerű „Amano" acilázt feloldunk 400 ml olyan 7 pH-jú 0,01 mólos trisz-maleát pufferoldatban, amely 5,10-4

mól kobaltkloridot tartalmaz. 4°-on való ultraszűrés és a szűrőn visszamaradt anyag liofilizálása után 3,8 g 828 E/g titerű terméket kapunk. A kapott enzim az eredeti terméknél háromszor hatékonyabb és hét és félszer tisztább (az aciláz aktivitás/ proteáz aktivitás arányból megállapítva). b) Enzimes dezacilezés 10 g DL-a-acetamido-(5,6-dihidro-l,4-ditiin-2-il)-ecetsavat feloldunk 5,10~4

mól kobaltkloridot tartalmazó 8 pH-jú 500 ml 0,05 mólos foszfátpuffer-oldatban. Az oldat pH-ját n nátriumkarbonát-oldattal 8-ra állítjuk be, majd hozzáadunk 1,35 g 828 E/g titerű acilázt, és pufferoldat hozzáadásával a térfogatot 2 literre egészítjük ki. A reakciókeveréket 24 óra hosszat 37°-on keverve, a dezacilezés végbe megy. Az L-izomernek a megfelelő aminosavvá való teljes átalakulását úgy biztosítjuk, hogy 0,3 g 250 E/g titerű acilázt adunk még hozzá, és az inkubálást 37°-on 1 óra hosszat tovább folytatjuk. A reakciókeveréket 20°-on hűtjük, és 15 cm átmérőjű „Amicon" cellában „Iris 3042" membránon ultraszűrjük. Az aciláz és a 20 000-nél nagyobb molekulasúlyú szennyező anyagok a cellában visszamaradtak. A reakciótermékek és a sók az ultraszüredékben vannak. Az enzimet a visszatartott anyag liofilizálásával nyerjük vissza. Az ultraszüredékben levő D-a-acetamido-(5,6-dihidro-l,4-ditiin-2-il)-ecetsavat úgy választjuk le, hogy a szüredéket sósavval 2 pH-ra megsavanyítjuk. A kivált terméket szűrőn elválasztjuk, 8 pH-jú alkalikus közegben újra feloldjuk, és az oldatot „Darco" aktív szénnel színtelenítjük. A szenet szűréssel eltávolítva és a szüredéket sósavval 2 pH-ra megsavanyítva, a tisztított sav kicsapódik. Az előző műveletekben kapott szüredékekből az L-a-amino-(5,6-dihidro-l,4-ditiin-2-ii)-ecetsavat úgy különítjük el, hogy sav állapotú 2 pH-jú „IR 120" gyantán 15 óra hosszat megkötve tartjuk, majd 1000 ml 8—9 pH-jú ammónia-oldattal eluáljuk. A szüredék pH-ját sósavval 7,5-re állítjuk be, és aceton hozzáadásával az L-a-amino-(5,6-dihidro-1,4-ditiin-2-il)-ecetsavat kicsapjuk. A csapadékot szűrőn elválasztjuk, 6,5 pH-jú vízben oldjuk, és az oldatot csökkentett nyomáson bepárolva a savat újra kicsapjuk. Ilymódon szűrőn elválasztás után 2 g L-a-amino-(5,6--dihidro-l,4-ditiin-2-il)-ecetsavat kapunk. A vegyület jellemzői a következők: Olvadáspontja 255—260° (bomlik). WD = +138° ±2° (c = 1, n sósav). A kiindulási anyagként használt <x-acetamido-(5,6-hidro-l,4-ditiin-2-il)-ecetsavat a következő módon állítjuk elő: 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 4