170786. lajstromszámú szabadalom • Eljárás MM-13902 antibiotikum-sók előállítására
17 170786 18 tással, és az Escherichia coli által termelt ß-läktamaz gátlásához szükségesnél nagyobb mennyiségben sem gátolja a monoamino-oxidáz, a szénsav-anhidráz, a dopa-dekarboxiláz, a tripszin, a kimotripszin és az ureáz enzim működését. 5 12. példa Az MM 4550 jelű komplex termék előállítása, és az MM 4550 és MM 13902 antibiotikumok 10 elkülönítése Az antibiotikumok elkülönítésére az előző példákban ismertetett elkülönítési módszereket különféle sorrendben kombinálhatjuk egymással. Egy különösen előnyös eljárásváltozat szerint — amelyet a következőkben rész- 15 letesen ismertetünk — a tisztítást szén-adszorpcióval kezdjük, ionpár-extrakcióval folytatjuk, és cellulózon végzett kromatografálással fejezzük be. 340 liter, a 3. példa szerinti eljárással előállított szűrt fermentlevet 800—1200 ml/perc sebességgel, alulról fel- 20 felé egy „Farneil BO" kereskedelmi nevű aktív szénnel töltött, 22,8 X 53,3 cm méretű oszlopon bocsátunk át. A töltetet előzetesen az MM 4550 jelű komplex termék adszorpciójára használtuk fel, majd regenerálás céljából 0,5 n vizes nátriumhidroxid-oldattal, 3: 2 arányú 0,2 n 25 vizes nátriumhidroxid-oldat: aceton eleggyel, vízzel, 1 n vizes sósavoldattal, vízzel, 6-os pH-értékű foszfátpufferoldattal, és végül ismét vízzel mostuk. A szűrt fermentlé átvezetése után az oszlopot 20 liter vízzel mossuk, majd felülről lefelé, 200—250 ml/perc 30 sebességgel 2: 8 térfogatarányú aceton: víz eleggyel eluáljuk. Az MM 4550 jelű komplex terméket tartalmazó frakciókat összegyűjtjük (az antibiotikumtartalmú komplex jelenlétét a korábban ismertetett, Klebsiella aerogenes-szel szemben végzett antibiotikum-diffúziós 35 módszerrel mutatjuk ki), és a 11 liter térfogatú oldatot vákuumban, 30 Cc-nál alacsonyabb hőmérsékleten 5,5 liter végtérfogatra betöményítjük. Ekkor az MM 4550 jelű komplex termék 20%-át különítjük el. A koncentrátumot 2 Cc -ra hűtjük, 5,5 liter —5 C°-ra 40 hűtött, 2 vegyes%-os diklórmetános tetra-n-butil-ammónium-hidrogénszulfát oldatot adunk hozzá, és a kétfázisú elegyet 2 percig keverjük. A diklórmetános fázist elválasztjuk, és 0 C°-on 1 liter 0,6%-os vizes nátriumjodid-oldathoz adjuk. A kétfázisú rendszert enyhén ke- 45 verjük, majd a vizes fázis pH-ját 2%-os vizes nátriumhidrogénkarbonát-oldat beadagolásával fokozatosan 6,5 és 7,0 közötti értékre állítjuk. A vizes fázist elválasztjuk és fagyasztva szárítjuk. A kapott szilárd anyagot a nátriumjodid eltávolítása céljából acetonnal extrahál- 50 juk, majd az oldhatatlan szilárd anyagot az aceton eltávolítása céljából vákuumkezelésnek vetjük alá. 1,1 g sárgás, porszerű terméket kapunk. Ekkor az MM 4550 jelű komplex termék 10%-át különítettük el; a tisztítási fok e lépés után — a szűrt fermentlé összes szilárd- 55 anyag-tartalmára vonatkoztatva — 125-szörös. 2,5 cm átmérőjű oszlopot 32 cm magasságig Whatman CC 31 cellulóz por és 7: 3 térfogatarányú izopropanol: : víz elegy keverékével töltünk meg. 500 mg, az előző lépésben kapott port 2 ml 7: 3 térfogatarányú izopro- 60 panol: víz elegyben oldva az oszlopra juttatunk, majd az oszlopot ugyanezzel az oldószerrel 1,5 ml/perc sebességgel eluáljuk. Az eluátumot 3 ml-es frakciókba gyűjtjük. Azokat a frakciókat, amelyek ultraibolya abszorpciós spektrumában körülbelül 285 nm-nél maximum 65 észlelhető, egyesítjük, betöményítjük, majd fagyasztva szárítjuk. MM 4550 jelű komplex terméket kapunk. (Korábbi kísérleteink során megállapítottuk, hogy a 285 nm-es abszorpciós maximummal rendelkező frakciók enzimgátló és antibakteriális hatású anyagot tartalmaznak.) 35 mg porszerű, barna, amorf terméket kapunk, amelynek I50 -értéke 0,0001 [xg/ml. Ekkor az eredeti hatóanyagmennyiség átlagosan 3%-át különítettük el. Az átlagos tisztítási fok 600-szoros volt. Az így kapott termék antibakteriális hatását a 10. példában ismertetett módszerrel vizsgáltuk. A 3. táblázatban felsoroltakhoz hasonló eredményeket kaptunk. A kapott termékből vékony-rétegkromatográfiás úton (adszorbens: Eastman Kodak „Chromagram" cellulózlemez, futtatószer: 7:7:6 térfogatarányú n-butanol: : izopropanol: vízelegy) két hatóanyagot különítünk el. A körülbelül 0,58 Rf -értéknél megjelenő termék az MM 4550 antibiotikum, míg a körülbelül 0,72 Rf -értéknél megjelenő termék az MM 13902 antibiotikum (dinátriumsó formájában). Mindkét antibiotikum bioautográfiás módszerrel, különféle mikroorganizmusok, köztük Bacillus subtilis, Staphylococcus aureus (Oxford), Staphylococcus aureus (penicillin-rezisztens), Escherichia coli (penicillin-érzékeny és penicillin-rezisztens), Salmonella typhimurium, Proteus mirabilis, Proteus morganii és Klebsiella aerogenes törzsek felhasználásával kimutatható. Néhány bioautográfiás mérés eredményeit a 4. táblázatban közöljük. t i. táblázat Zónaátmérő, mm Mikroorganizmus MM 4550 MM 13902 (Rf =0,58) (Rf =0,70) Klebsiella aerogenes 20,0 20,0 Proteus mirabilis 17,5 13,5 Proteus morganii 16,0 9,5 Salmonella typhi 19,5 21,0 Escherichia coli 10418 20,0 13,5 Escherichia coli Bll 17,5 10,5 Enterobacter aerogenes 6,5 nincs zóna Staphylococcus aureus (Oxford) 13,0 4,0 Staphylococcus aures (Russell) 12,0 4,0 Bacillus subtilis 24,0 15,0 Egy másik kísérletben a vékonyréteg-kromatográfiás elválasztáshoz futtatószerként 8: 2 arányú izopropanol: : vízelegyet használtunk fel, és a kapott anyagokat foszfátpufferral oldottuk le a cellulóz-lemezről. Vizsgálataink szerint mindkét anyag gátolja az Escherichia coli által termelt ß-laktamaz hatását, és mindkét anyag szinergetikusan fokozza a benzilpenicillin Klebsiella aerogenes-szel szemben kifejtett aktivitását. 13. példa Az MM 4550 jelű komplex termék előállítása és az MM 4550 és MM 13902 antibiotikum elkülönítése Streptomyces olivaceus ATCC 31126 fermentációjával kapott, 1100 liter térfogatú szűrt fermentlevet 5 C°-9
