170786. lajstromszámú szabadalom • Eljárás MM-13902 antibiotikum-sók előállítására

19 170786 20 -on, pH = 6,5 értéken, 3,2 liter/perc sebességgel egy „Darco" granulált aktív szénnel töltött, 0,3 X 1 m méretű oszlopon bocsátunk át. Az aktív szenet előzetesen MM 4550 komplex termék adszorpciójára használtuk fel, majd regenerálás céljából 0,5 n vizes nátriumhidroxid-oldattal,^3: 2 arányú 0,2 n vizes nátriumhidroxid-oldat: aceton eleggyel, vízzel, 1 n vizes sósavoldattal, vízzel, pH = 6 értékű foszfátpufferral, végül ismét vízzel mostuk. A fermentlé átbocsátása után az oszlopot 60 liter vízzel mossuk, majd 30 C°-on, 1,1 liter/perc sebességgel 2: 8 térfogatarányú aceton: víz eleggyel eluáljuk. 60 liter eluátum összegyűjtése után a további eluátummennyiséget 5 X10 literes frakciókban fogjuk fel. Azokat a frakciókat, amelyek a Klebsiella aerogenes-szel szemben végzett agar-diffúziós kísérletben antibakteriális aktivitást mutatnak, egyesítjük, és a kapott 40 liter térfogatú oldatot vákuumban, 30 C°-nál alacsonyabb hőmérsékleten 32 liter végtérfogatra bepároljuk. Ekkor az MM 4550 jelű komplex termék 15%-át különítettük el. A koncetrátumot 5 C°-ra hűtjük, 16 liter 5 C°-os, 0,2%-os diklórmetános cetil-dimetil-benzil-ammóniumklorid oldatot adunk hozzá, és a kétfázisú rendszert 5 percig keverjük. A diklórmetános fázist elválasztjuk, és 3,75 liter 5 C°-os, 0,4%-os vizes nátriumjodid-oldathoz adjuk. A kétfázisú rendszert 5 percig keverjük, majd a vizes fázist elválasztjuk és fagyasztva szárítjuk. A száraz, szilárd anyagot a nátriumjodid eltávolítása érdekében vízmentes acetonnal extraháljuk, és a maradékként kapott szilárd anyagot vákuumban szárítjuk. 2,87 g sárgás, porszerű terméket kapunk. Ekkor az MM 4550 jelű komplex termék 6%-át különítettük el. A tisztítás foka — a szűrt fermentlé teljes szilárd anyag tartalmára vonatkoztatva —• 160-szoros. Egy 63 mm átmérőjű oszlopot 300 mm magasságig Whatman CC 31 cellulóz-por és 4: 1 térfogatarányú n-propanol: vízelegy keverékével töltünk meg. Az oszlopra 198 mg, a fentiek szerint kapott barna, szilárd anyag 1: 1 térfogatarányú víz: n-propanol eleggyel készített oldatát visszük fel, majd az oszlopot 0,5 ml/perc sebességgel 4: 1 térfogatarányú n-propanol :Jvízeleggyel eluáljuk. Az eluátumot 6 ml-es frakciókba gyűjtjük, a frakciókat Klebsiella aerogenes-szel szemben biológiailag vizsgáljuk, és minden egyes frakció ultraibolya spektrumát felvesszük. A 23—28. frakciót, amely ultraibolya abszorpciós spektrum alapján (maximum körülbelül 305 nm-nél) az MM 13902 antibiotikum di-nátriumsóját tartalmazza, egyesítjük, vákkumban betöményítjük, majd a maradékot fagyasztva szárítjuk. 30 mg szilárd anyagot kapunk. A termék vékony-rétegkromatográfiás vizsgálat során (adszorbens: Eastman Kodak cellulóz-lemez, futtatószer: 4: 1 térfogatarányú n-propanol: vízelegy) csak egyetlen, Rf =

0,77 értéknél megjelenő, antibakteriális aktivitású foltot mutat. A folt biológiai aktivitását Bacillus subtilis felhasználásával végzett bioautográfiával határozzuk meg. A 29—40. frakciót, amely ultraibolya spektrum alapján (maximum körülbelül 285-nél) az MM 4550 antibiotikumot tartalmazza, egyesítjük, vákuumban betöményítjük, és a koncentrátumot fagyasztva szárítjuk. 53 mg szilárd anyagot kapunk. Ez a termék az MM 4550 antibiotikum sóját csekély mennyiségű MM 13902 antibiotikum-sóval együtt tartalmazza. 14. példa A kiindulási anyag előállításához felhasznált mikroorganizmusok ismertetése 5 A biológiai kutatások során először az ATCC 21379, ATCC 21380, ATCC 21381 és ATCC 21382 letéti számú, spanyolországi, új-zélandi, dél-afrikai,'illetve izraeli talajmintákból elkülönített mikroorganizmusok MM 10 4550 jelű komplex terméktermelő képességét ismerték fel. A laboratóriumi kutatások során kitűnt, hogy ezek a mikroorganizmusok azonosak, és a Hütter rendszer alapján (Systematic der Streptomyceten, S. Karger, Basel, 1967, 382. és következő oldalak) a Streptomyces 15 olivaceus speciesbe tartoznak. Amint az 5. táblázat adataiból kitűnik, egyéb Streptomyces-törzsek is képesek MM 4550 jelű komplex termék termelésére. A Streptomyces olivaceust elsőként Waksman ismertette (Cultural Studies of Species of Actinomyces, Soil. 20 Sei., 8, 71—215 [1919]). Később Kuchaeva és munkatársai egy, a Streptomyces olivaceushoz nagymértékben hasonló, általuk Actinomyces (Streptomyces) fulvoviridis-nek nevezett törzset ismertettek (Trud. Inst. Mikrobiol., Akad. Nauk. SSSR, 8, 226—253 [I960]). 25 A Streptomyces-nembeli mikroorganizmusok morfológiai és fiziológiai jellemzői a növekedési körülményektől függően igen széles határok között változnak. Az azonos törzsek e rendkívüli változékonyságának felismerése előtt igen sokféle Streptomyces törzset jelöltek 30 eltérő névvel, annak ellenére, hogy ezek a törzsek alapvetően azonosak voltak. Hütter a fent idézett közleményében 25 olyan Streptomyces-törzset ismertetett, amelyek a Streptomyces olivaceussal lényegében azonosnak tekinthetők, a szakirodalomban azonban más néven 35 szerepelnek. E törzsek közé tartozik a Streptomyces fulvoviridis is. A Streptomyces-törzsek egységes nomenklatúráját 1962-ben kezdték kidolgozni („International Streptomyces Project" [I. S. P.]). Shirling és munkatársai 1968-ban megjelent közleményükben (Int. J. 40 Syst. Bacteriol. 18, 69—189) több mint 400, mindeddig különböző névvel megjelölt Streptomyces-törzs (köztük a Streptomyces olivaceus és a Streptomyces fulvoviridis) azonos körülmények között észlelt növekedési jellemzőit ismertették. 45 . E közlemény szerint a Streptomyces olivaceus és a Streptomyces fulvoviridis csak két jellemző, nevezetesen a sporofórák alakja és az inozit-hasznosítás tekintetében tér el egymástól. E közlemény szerint a Streptomyces olivaceus jellem-50 zői a következők: A spóralánc morfológiája: nyílt spirálokat tartalmazó, spirális láncok, amelyeket rektiflexibilis spóraláncok szakítanak meg. Az érett spóraláncok általában hosszúak, gyakran lánconként 50-nél több spórát tartalmaznak. 55 Szénforrás-hasznosítás: a mikroorganizmus a D-glükózt, az L-arabinózt, a D-xilózt, az i-inozitot, a D-mannitot, a D-fruktózt és a ramnózt hasznosítja, szacharózon és raffinózon azonban egyáltalán nem, vagy csak alig növekedik. 60 A Streptomyces fulvoviridis jellemzői az alábbiak: A spóralánc morfológiája: rektiflexibilis spóralánc. Az érett spóraláncok viszonylag rövidek, és lánconként általában 10—50 spórát tartalmaznak. Szénforrás-hasznosítás: a mikroorganizmus a D-glü-65 kózt, az L-arabinózt, a D-xilózt, a D-mannitot, a D-10