170786. lajstromszámú szabadalom • Eljárás MM-13902 antibiotikum-sók előállítására
15 170786 16 9. példa MM 4550 és MM Í3902 antibiotikumot tartalmazó, részlegesen tisztított termék előállítása gélszűréssel 1 g, a 4. példa szerint előállított nyers, MM 4550 jelű komplex terméket (I50 = 0,2 ^g/ml) „finom" minőségű Sephadex G25 gélen kromatografálunk, eluálószerként 4:6 térfogatarányú aceton: víz elegyet használunk. Az oszlop mérete 2,5 X32 cm. Az eluálást 1,5 ml/perc sebességgel végezzük. Az aktív frakciókat egyesítjük, vákuumban, 30 C°-nál alacsonyabb hőmérsékleten bepároljuk, majd a maradékot fagyasztva szárítjuk. 22 mg amorf, sárgás, szilárd anyagot kapunk; I50 =0,005 [Xg/ml. Ennek megfelelően az antibiotikumot 88%-os hozammal, 40-szeres tisztítási faktorral különítettük el. 10. példa MM 4550 és MM 13902 antibiotikumot tartalmazó, részlegesen tisztított termék előállítása cellulóz-oszlopon végzett kromatografálással 610 mg, a 7. példa szerint előállított, MM 4550 jelű komplex terméket 2,5 X 32 cm méretű, Whatman CC 31 kereskedelmi nevű cellulózzal töltött oszlopon kromatografálunk. Eluálószerként 7: 3 térfogatarányú izopropanol: víz elegyet használunk, és az eluálást 1,5 ml/perc sebességgel végezzük. Az antibakteriális hatással rendelkező frakciókat egyesítjük, vákuumban, 30 C°nál alacsonyabb hőmérsékleten betöményítjük, és fagyasztva szárítjuk. 40 mg barna, amorf, szilárd antibiotikum-keveréket kapunk; I50= 0,00007 [xg/ml. Az igen kis I50 érték azt jelzi, hogy az így kapott termék lényegesen tisztább a kiindulási anyagnál. Egy másik kísérletben a fenti eljárással 0,001 [xg/ml I50 -értékű terméket kaptunk. E termék antibakteriális hatását Oxoid táptalajon, mikrotitrálásos módszerrel határoztuk meg. A vizsgálandó mikroorganizmusokat egy éjszakán át tenyésztettük, és a táptalajra 1% így kapott tenyészetet vittünk fel. Az eredményeket a 3. táblázatban közöljük. 3. táblázat A 10. példa szerint kapott, 0,001 [xg/ml I50 -értékű termék antibakteriális hatása Mikroorganizmus MGK, (Jg/ml Staphylococcus aureus (Oxford) 7,5 Staphylococcus aureus (Russell) 7,5 Streptococcus faecalis 125 Bacillus subtilis 0,9 Escherichia coli 10418 3,7 Escherichia coli Bl 1 15 Klebsiella aerogenes 1,8 Enterobacter cloaceae 62 Proteus mirabilis 7,5 Providentia stuartii 7,5 Acinetobacter antitratus 0,9 Pseudomonas aeruginosa 250 Serratia marcescens 7,5 Salmonella typhimurium 15 Shigella sonnei 7,5 11. példa Az MM 4550 antibiotikum jellemzői 5 Az MM 4550 antibiotikum savjellegű, szilárd vegyület. E termék nátriumsójának jellemző sajátságait az alábbiakban soroljuk fel. (i) A só vízben igen jól oldódik, metanolban oldható, kloroformban, dietiléterben és szénhidrogénekben lénye-10 gében oldhatatlan. (ii) A só vizes oldatának ultraibolya spektrumában körülbelül 238 és 287 nm értéknél jellemző abszorpciós maximum jelenik meg. (iii) A só frissen készített káliumbromid-pasztillában 15 felvett infravörös abszorpciós spektrumában körülbelül 3450, 2950, 1765, 1695, 1510, 1390 és 1260 cm" 1 értéknél jellemző abszorpciós maximum jelenik meg. Ha a spektrumot 1 héttel a káliumbromid-pasztilla előállítása után vesszük fel, a spektrum nagymértékben megválto-20 zik, így például a körülbelül 1765 cm-" 1 értéknél megjelenő nagy csúcs eltűnik, vagy a csúcs mérete jelentősen csökken. A káliumbromid-pasztilla minden esetben 0,4 súly% antibiotikum-sót tartalmaz, (iv) A só deutériumoxidban felvett NMR-spektrumá-25 ban többek között az alábbi jellemző sávok észlelhetők: (a) körülbelül 2,45 T és 3,65 T centrumú dublett-pár (csatolási állandó: körülbelül 15 Hz); (b) körülbelül 8,55 T centrumú dublett; (c) körülbelül 7,95 T centrumú éles szingulett. 30 (v) A só cellulóz-vékonyrétegen felvett kromatogramjában az alábbi közelítő Rf -értékek észlelhetők: Rf = 0,6 (7: 7: 6 térfogatarányú butanol: izopropanol: : víz eleggyel futtatva), Rf = 0,7 (7: 3 térfogatarányú izopropanol: víz eleggyel 35 futtatva), Rf = 0,7 (7: 7: 6 térfogatarányú n-butanol: etanol: víz eleggyel futtatva), és Rf = 0,6 (4: 1 térfogatarányú n-propanol: víz eleggyel futtatva). 40 (vi) A só igen sokféle mikroorganizmus-törzzsel, köztük a Staphylococcus aureus, Bacillus subtilis, Escerichia coli, Klebsiella aerogenes, Proteus mirabilis, Acinetobacter anitratus, Serratia marcescens és Shigella sonnei törzsekkel szemben antibakteriális hatást fejt ki. 45 (vii) A só különböző mikroorganizmus-törzsek, köztük az Escherichia coli, Klebsiella aerogenes és Staphylococcus aureus törzsek által termelt (i-laktamázokkal szemben gátló hatást fejt ki. A sónak az Escherichia coli Bll által termelt ß-laktamazzal szemben a fent ismer-50 tetett módon meghatározott IJ0 -értéke 0,0001 [xg/ml-nél kisebb. (viii) A só ampicillinnel együtt adagolva szinergetikusan fokozza az ampicillin különféle mikroorganizmusokra, köztük az Escherichia coli, Klebsiella aerogenes, 55 Proteus mirabilis, Proteus morganii és Staphylococcus aureus Russell-törzsekre kifejtett hatását. (ix) Az aminosav-elemzés alapján a termék nem polipeptid, és nem fehérje. Savas hidrolízis után a-amino-adipinsav nem mutatható ki. 60 (x) A só Ehrlich-reagenssel (54 ml n-butanol, 9 ml etanol és 9 ml tömény sósavoldat elegyében oldott 300 mg 4-dimetilamino-benzaldehid) kezelve kromatográfiás papíron és vékony-rétegkromatográfiás lemezen kék elszíneződést ad. 65 (xi) A só nem rendelkezik általános enzimgátló ha-8
