170786. lajstromszámú szabadalom • Eljárás MM-13902 antibiotikum-sók előállítására

170786 10 feljegyezzük a 100 másodperc alatt bekövetkező optikai sűrűségváltozást. Az inhibitor-oldatot addig hígítjuk, amíg el nem érjük az alapreakció sebességét 50%-ban gátló dózist. 2. példa KAG-vizsgálat A KAG-vizsgálat a fermentlevekben, illetve feldolgozott fermentlevekben jelenlévő ß-laktamaz-inhibitorok kimutatására szolgál. 45 C°-os, ömlesztett tápagart ßlaktamáz-termelő Klebsiella aerogenes törzzsel oltunk be, majd az elegyhez annyi steril penicillin G-oldatot adunk, hogy az agar milliliterenként 6 ptg penicillin G-t tartalmazzon. Az így kapott elegyet Petri-csészébe töltjük, megszilárdulni hagyjuk, majd steril fémkés segítségével az agar-rétegben több, egymástól egyenlő távolságban elhelyezkedő, hengeres mélyedést vágunk. A vizsgálandó oldatok mintáit a mélyedésekbe cseppentjük, majd a rendszert 27 C° és 37 C° közötti, állandó hőmérsékleten inkubáljuk. Az inkubálás során a vizsgálandó oldatban jelenlévő inhibitor az agar-rétegbe diffundál, és gátolja a Klebsiella-sejtek által termelt ß-laktamáz hatását. Ennek megfelelően a ß-laktamaz nem képes lebontani a penicillin G-t, így a penicillin G az inhibitortartalmú oldattal töltött üregek környezetében meggátolja a Klebsiella-törzs növekedését. (Az inhibitort nem tartalmazó oldattal töltött üregek környezetében a Klebsiella-törzs akadálytalanul növekedik.) Az inhibitortartalmú oldattal töltött üregek környezetében tehát mikroorganizmus-mentes gátló zónák alakulnak ki; a gátló zónák átmérője arányos az oldat inhibitortartalmával. A kapott adatokból az inhibitorkoncentráció logaritmusát a zónaátmérő függvényében feltüntető kalibrációs görbe segítségével kiszámíthatjuk a vizsgált oldatok inhibitor-tartalmát. 3. példa Az 1 363 075 sz. brit szabadalmi leírás szerinti MM 4550 jelű komplex termék előállítása Streptomyces olivaceus ATCC 21379 törzset Roux lombikokban, ferde tenyészeten 7 napon át 28 C°-on tenyésztünk. A következő összetételű táptalajt használjuk fel: szójababliszt glükóz-monohidrát csapvíz 10,0 g/l 20,0 g/l ad 1 liter élesztőkivonat* glükóz-monohidrát agar* * csapvíz 10,0 g/l 10,0 g/l 15,0 g/l ad 1 liter * „Yeatex" kereskedelmi nevű termék, a Bovril Food Ingredients cég (Buorton-on-Trent, Nagy-Britannia) gyártmánya ** az Oxoid Limited cég (London, Nagy-Britannia) gyártmánya Sterilizálás előtt a közeg pH-ját 6,8 értékre állítjuk. A Roux-lombikokba 0,02% Tween 80-at (polioxietilén-szorbitán-monooleát) tartalmazó 50 ml steril, ionmentes vizet töltünk, és a spórákat rázás közben szuszpendáljuk. Az így kapott spóraszuszpenziót használjuk fel az oltóközeg inokulumaként. Az oltóközeg összetétele a következő: 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 (Szójabablisztként „Arkasoy 50"-t [gyártja a British Arkady Co. Ltd., Manchester, Nagy-Britannia] használunk fel.) 75 liter fenti összetételű közeget 100 literes rozsdamentes acél fermentorba töltünk, a közeghez 50 ml 10 térfogat %-os szójaolajas Pluronic L81-oldatot (etilénoxid-propilénoxid tömbpolimer alapú habzásgátló, gyártja a Jacobsen van den Berg U. K. Ltd. cég [London, Nagy-Britannia]) adunk, majd a közeget vízgőzzel 20 percig 120 C°-on sterilizáljuk. Ezután az előző lépésben kapott spóraszuszpenziót beadagoljuk, majd a tenyészetet 20,4 cm átmérőjű lapátos keverővel 340 fordulat/perc sebességgel keverjük, és a tenyészetbe 150 liter/perc sebességgel steril levegőt vezetünk. A fermentort záróelemekkel látjuk el. A rendszerint a fenti körülmények között 45 órán át 28 C°-on inkubáljuk. 7,5 liter így kapott oltótenyészetet használunk fel a következő fermentációs lépés oltóanyagaként. 300 literes rozsdamentes fermentorba 150 liter steril, alábbi összetételű elegyet töltünk: szójababliszt („Arkasoy 50") 10,0 g/l glükóz-monohidrát 20,0 g/l lecsapott kalciumkarbonát 0,2 g/l kobaltklorid-hexahidrát 0,001 g/l csapvíz ad 1 liter Az elegyhez habzásgátlóként 300 ml 10%-os szójaolajas Pluronic L81 oldatot adunk. 48 órás fermentáció után a zagyot centrifugáljuk, és a fermentlevet elkülönítjük. A kapott fermentlé 1: 100 000 arányban hígított mintája az enzimgátlás vizsgálata során 50%-os gátlást biztosít. 100 liter így kapott fermentléhez 12 kg nedves súlyú, acetát-formájú Whatman DE32 ioncserélő gyantát adunk (dietilaminoetil-csoportokat hordozó mikrokristályos cellulóz-gyanta, gyártja a H. Reeve Angel and Co. cég, London, Nagy-Britannia), az elegyet keverjük, majd a gyantát kiszűrjük. A cellulóz-gyantáról 12 liter 0,5 mólos káliumszulfát-oldattal leoldjuk az MM 4550 jelű komplex terméket. Az eluátumot filmbepárlón, vákuumban, 30 C°-nál alacsonyabb hőmérsékleten 6 liter végtérfogatra bepároljuk, majd a koncentrátumhoz 12 liter acetont adunk, és így leválasztjuk a káliumszulfát főtömegét. A szilárd anyagot kiszűrjük, és a szűrletet vákuumban, 30 C°-nál alacsonyabb hőmérsékleten 200 ml végtérfogatra bepároljuk. A kapott koncentrátumot 76 mm X 2 m méretű, Amberlite XAD—4 ioncserélő gyantával (nem-ionos polisztirol gyanta, a Rohm and Haas Co., Philadelphia, Amerikai Egyesült Államok terméke) töltött oszlopra visszük fel. A gyantaoszlopot ionmentes vízzel eluáljuk, és az eluátumot 140 ml térfogatú frakciókba gyűjtjük. A KAG-vizsgálat alapján aktívnak bizonyult frakciókat egyesítjük, és a kapott, 2,2 liter térfogatú oldatot 2,4 atmoszféra nitrogén-nyomáson végzett ultraszűréssel 275 ml végtérfogatra töményítjük be. Az ultraszűréshez 150 mm átmérőjű Amicon UM—05 membránt használunk fel (gyártja az Amicon Ltd. cég, High Wycombe, Nagy-Britannia). A kapott koncentrátumot fagyasztva szárítjuk. 2,2 g barna, porszerű terméket kapunk; I50 =0,004 [xg/ml. 1 g így kapott terméket 1 liter 0,2 mólos nátrium-5