170786. lajstromszámú szabadalom • Eljárás MM-13902 antibiotikum-sók előállítására
170786 7 8 1973. évi bécsi szimpózium anyagának 241. oldala). E módszerek közül a következőket soroljuk fel: (i) Mutagen szerek, így ionizáló sugárzás, ultraibolya sugárzás* ultraibolya sugárzás és fotoszenzibliizáló szer (például 8-metoxi-sporalén), salétromossav, hidroxilamin, pirimidin-analógok (így 5-bróm-uracil), akridinek, alkilezőszerek (így mustárgáz, etil-metánszulfonát), hidrogénperoxid, fenolok, formaldehid vagy hő alkalmazása; és (ii) genetikus módszerek, így rekombináció, transzformáció, transzdukció, lizogenizálás, lizogén átalakulás és a spontán mutáció útján képződött mutánsok szelektív elkülönítése. Vizsgálataink szerint mutagen szerek alkalmazásával olyan mikroorganizmusok alakíthatók ki, amelyek fokozottmértékben termelik a kívánt antibiotikumot. így például, ha a Streptomyces olivaceus ATCC 21379 törzset besugározzuk, majd a KAG-kísérletben a legnagyobb aktivitási zónával rendelkező mutáns törzset elkülönítjük, a Streptomyces olivaceus ATCC 31126 törzshöz jutunk, amely kiemelkedően jó eredménnyel alkalmazható a komplex antibiotikum előállítására. A Streptomyces olivaceus ATCC 31126 törzset Hollandiában CBS 155.75 számon helyeztük letétbe. A kívánt MM 4550 antibiotikum elkülönítését és tisztítását általában viszonylag alacsony, például 20 C° alatti, előnyösen 12 C° alatti hőmérsékleten végezzük. A kívánt antibiotikumot rendszerint főtömegében a szűrt fermentléből különíthetjük el; ennek megfelelően az elkülönítési műveletsor első lépéseként általában a szilárd anyagokat távolítjuk el a fermentációs zagyból. Ezután a derített, szűrt fermentlevet megfelelő abszorbensen, például aktív szénen abszorbeáltatjuk, majd az antibiotikumot megfelelő oldószerrel, például vizes acetonnal leoldjuk az abszorbensről. Ezzel az eljárással szennyezett MM 13902 antibiotikum-sót (rendszerint az antibiotikum di-sóját) kapjuk. Eljárhatunk úgy is, hogy a szűrt fermentlevet lipofil ammóniumsó jelenlétében valamely vízzel nem elegyedő oldószerrel extraháljuk. Ez a módszer rendszerint kedvezőbb a fent ismertetett eljárásmódnál. A kapott szerves fázis csökkentett nyomáson végzett bepárlásával a komplex antibiotikumot szubsztituált ammóniumsója formájában különíthetjük el. Előnyösen úgy járunk el, hogy a komplex antibiotikum szubsztituált ammóniumsóját tartalmazó szerves oldatot vizes alkálifém-jodidoldattal, például vizes nátriumjodid-oldattal újból extraháljuk; ekkor az MM 13902 antibiotikum alkálifémsója formájában a vizes fázisba lép át. A fenti módszerrel végtermékként szennyezett MM 13902 antibiotikumsót (rendszerint di-sót) kapunk. -A fenti módon előállított szennyezett MM 13902 antibiotikum-sót ezután rendszerint a korábban ismertetett kromatográfiás módszerekkel tisztítjuk. ; A fermentációs eljárásban felhasznált Streptomyces olivaceus törzsek és egyéb mikroorganizmusok a következő jellemző sajátságokkal rendelkeznek: (a) A mikroorganizmusok szürke vagy sárga színű, spórás légmicéliumokkal rendelkeznek. (b) A mikroorganizmusok spórahordozói rektiflexibilis vagy spirális alakúak. (c) A mikroorganizmusok spórái sima felületűek. (d) A mikroorganizmusok nem termelnek melanint. Az egyes mikroorganizmusok jellemző sajátságait az 5-^9. táblázatban foglaljuk össze. A találmány szerinti eljárást az oltalmi kör korlátozása nélkül az alábbi példákban részletesen ismertetjük. 5 1. példa Az I50 -érték meghatározása Az I50 -érték az a hatóanyagmennyiség, amely 50%-10 -ban gátolja az ampicillinnek az Escherichia coli Bl 1 által termelt ß-laktamaz enzim hatására végbemenő hidrolízisét. Az Escherichia coli Bll R-faktorral szabályozott ß-laktamaz enzimet tartalmaz. Ez az enzim a Richmond-Sykes rendszer Illa osztályába tartozik (Adv. 15 in Microbiol. Physiol. 9, 31 [1973]). Az ampicillin ß-laktamazok hatására végbemenő, penicillinsavhoz vezető hidrolízisének sebességét jodometriás úton határozhatjuk meg. E módszer szerint a keményítő-jód komplex elszíneződésének üteméből kö-20 vetkeztetünk a penicillinsav képződésének sebességére. Az eljárást, és a ß-laktamaz előállítását M. Cole, S. Elsőn és P. D. Fullbrook ismerteti (Biochemical Journal 127, 295—308 [1972]). Az ott ismertetett módszert csak annyiban módosítottuk, hogy az inhibitor mintáját 15 25 percig előinkubáltuk az enzimmel, és ezután adtuk az ampicillinhez. A meghatározáshoz a következő reagenseket használtuk fel: (1) 0,05 mólos káliumfoszfát-pufferoldat (pH = 7) 30 (2) Novick módszerével (Biochem. J. 83, 236 [1962]) előállított keményítő/jód oldat (3) ampicillin pufferoldattal készített, 40 [Ag/ml koncentrációjú oldata (4) Escherichia coli Bll törzsből Cole és munkatársai 35 módszerével (Biochem. J. 127, 295 [1972]) előállított ß-laktamáz enzim. Az enzimet pufferoldattal olyan koncentrációra hígítjuk, hogy az inhibitort nem tartalmazó ampicillin-mintához adva a rendszer optikai sűrűsége 100 másodperc alatt körülbelül 0,3 egységgel csökken-40 jen. Az eljárásban egyéb ß-laktamaz-termelo Escherichia coli-törzseket (elsősorban R-faktort (például R TEM-t) tartalmazó törzseket) is felhasználhatunk. A méréshez SP 800 Pye Unicam spektrofotométert használunk fel. A vizsgálandó elegyet a spektrofoto-45 méter 1 cm élhosszú küvettáiba töltjük, és a mérést 37 C°-on végezzük. A műszer 8 küvettát tartalmaz. 4 küvettába vizsgálandó anyagot töltünk, míg a fennmaradó 4 küvettába összehasonlító oldatot helyezünk. Az első küvetta-pár az inhibitor távollétében lezajló 50 reakció vizsgálatára szolgál; a további három küvettapárba változó mennyiségű inhibitort mérünk be. így például a 2. küvetta-párba a következő összetételű elegyet tölthetjük: Komponens Mérőküvetta Összehasonlító küvetta Keményítő/jód reagens 1,0 ml 1,0 ml ß-laktamaz 0,1 ml — Pufferoldat 0,3 ml 0,4 ml 60 Inhibitor-oldat 0,1 ml 0,1 ml Ampicillin-oldat (15 perc elteltével beadagolva) 1,0 ml 1,0 ml A minták optikai sűrűségét 590 nm hullámhosszon 65 mérjük. Az egyes méréseket 3—6 percig végezzük, és
