170670. lajstromszámú szabadalom • Eljárás peptid-peptidohidroláz-típúsú proteolitikus enzimek mennyiségének meghatározására, és eljárás a reagensek előállítására
19 170670 20 amely vékonyrétegkromatográfiásan (futtatószer: Pj elegy) egységes. [a]p = —9,66° (c = l,0, dimetilformamidban). b) lépés: H-Tyr-Val-Arg-pNA.HCl (XX) Kiindulási anyagként 144,7 mg (0,169 mmól) (XXa) képletű vegyületet használunk. A reakciót az 1. példa g) lépésében leírt módon végezzük. A nyers terméket 20%-os ecetsavban, Sephadex G—15 gélen szűrjük. Az eluátumot fagyasztva szárítjuk. 65,4 mg (62%) amorf, 11,20% klórtartalmú (XX) képletű vegyületet kapunk, amely vékonyrétegkromatográfiásan (futtatószer: A elegy) egységes. [a]|>3 = -29,8° (c=0,63, 50%-os ecetsavban). Aminosav-elemzés eredménye: Val: 1,0; Tyr: 1,2; Arg: 1,0. 21. példa N«-Bz-Tyr-Val-Arg-pNA.HCl (XXI) a) lépés: N*-Bz-Tyr-Val-Arg(N02)-pNA (XXIa) Kiindulási anyagként 246 mg (0,287 mmól) (XXa) képletű vegyületet és 65 mg (0,29 mmól) Bz2 0-t használunk. A reakciót az 1. példa d) lépésében leírt módon végezzük. A brómhidrogénes kezelés során a tirozinegység hidroxil-csoportját védő benzil-csoportok egy része lehasad. A terméket ezért kis hozammal kapjuk. A termék lényegében (XXIa) képletű vegyület és Na -Bz-Tyr(OBz)-Val-Arg(N02)-pNA elegye. Az elegyet metanolban, Sephadex LH—20 gélen szűrjük. 193 mg (81%) amorf anyagot kapunk, amely vékonyrétegkromatográfiás elemzés alapján (futtatószer: Pj elegy) két vegyületet tartalmaz. b) lépés: N"-Bz-Tyr-Val-Arg-pNA.HCl (XXI) Kiindulási anyagként 138,9 mg (XXIa) képletű vegyületből és Na -Bz-Tyr OBz^Val-ArgíNO^-pNA-ból álló elegyet használunk. A reakciót az 1. példa g) lépésében leírt módon végezzük. A terméket 50%-os ecetsavban, Sephadex G—15 gélen szűrjük. Az eluátumot fagyasztva szárítjuk. 75,4 mg amorf, 5,3% klórtartalmú (XXI) képletű vegyületet kapunk, amely vékonyrétegkromatográfiásan (futtatószer: A elegy) egységes. [ag?= —34,7° (c=0,7, 50%-os ecetsavban). Aminosav-elemzés eredménye: Val: 1,0; Tyr: 1,2; Arg: 1,0. 22. példa Na -4-aminometil-ciklohexilkarbonil-Phe-Val-Arg-pNA.2HCl(XXII) a) lépés: Cbo-4-aminometil-ciklohexilkarbonil-Phe-Val-Arg-pNA (XXIIa) Kiindulási anyagként 268 mg (0,65 mmól) Cbo-4--aminoetil-ciklohexilkarbonil-OpNP-t és 360 mg (0,5 mmól) (Ic) képletű vegyületet használunk. A reakciót az 1. példa b) lépésében leírt módon végezzük. A nyers terméket metanolban, Sephadex LH—20 gélen szűrjük. 265 mg (62%) amorf (XXIIa) képletű vegyületet kapunk, amely vékonyrétegkromatográfiásan (futtatószer: P! elegy) egységes, [ag? = -8,5° (c=0,51, dimetilformamidban). 5 b) lépés: NM-ammometil-ciklohexilkarbonil-Phe-Val-Arg-pNA.2HCl (XXII) Kiindulási anyagként 137 mg (0,16 mmól) (XXIIa) képletű vegyületet használunk. A reakciót az 1. példa g) 10 lépésében leírt módon végezzük. A nyers terméket 33%-os ecetsavban, Sephadex G—15 gélen kromatografálva tisztítjuk. Eluálószerként metanolt használunk, és az egyes eluátum frakciókat vékonyrétegkromatográfiásan vizsgáljuk. A tiszta terméket tartalmazó eluátu-15 mot fagyasztva szárítjuk. 82,2 g (68,5%) amorf, 9,37% klórtartalmú (XXII) képletű vegyületet kapunk, amely vékonyrétegkromatográfiásan (futtatószer: A elegy) egységes. [aß5 =-35,2° (c=0,73, 50%-os ecetsavban). Aminosav-elemzés eredménye: Val: 1,0; Phf& 1,1; 20 Arg: 1,0. 23. példa 25 Na -2-ciklohexil-acetil-Phe-Val-Arg-pNA. HCl (XXIII) a) lépés Na -2-ciklohexil-acetil-Phe-Val-Arg(N0 2 )-pNA (XXIIIa) 30 Kiindulási anyagként 197 mg (0,75 mmól) ciklohexil-acetil-OpNP-t és 331 mg (0,46 mmól) (Ic) képletű vegyületet használunk. A reakciót az 1. példa b) lépésében leírt módon végezzük. A nyers terméket metanol-35 ban, Sephadex LH—20 gélen szűrjük. 205 mg (63%) amorf (XXIIIa) képletű vegyületet kapunk, amely vékonyrétegkromatográfiásan (futtatószer: Pt elegy) egységes. [«]D = — 5,0° (c = 0,5, dimetilformamidban). 40 b) lépés: N0l -2-ciklohexil-acetil-Phe-Val-Arg-pNA. HCl (XXIII) 173 mg (0,244 mmól) (XXIIIa) képletű vegyületből indulunk ki. A reakciót az 1. példa g) lépésében leírt 45 módon végezzük. A nyers terméket 33%-os ecetsavban, Sephadex G—-15 gélen szűrjük. Az eluátumot fagyasztva szárítjuk. 139 mg (81%) amorf, 5,01% klórtartalmú (XXIII) képletű vegyületet kapunk, amely vékonyrétegkromatográfiásan (futtatószer: A elegy) egységes. 50 [a]g= -32,0° (c=0,35, 50%-os ecetsavban). Aminosav-elemzés eredménye: Val: 1,0; Phe: 1,1; Arg: 1,0. 24. példa 55 NM-Aminobutiril-Phe-Val-Arg-pNA. 2HC1 (XXIV) a) lépés: Cbo-4-aminobutiril-Phe-Val-Arg(N02 )-pNA (XXIVa) 60 Kiindulási anyagként 234 mg (0,65 mmól) Cbo-4--aminobutiril-OpNP-t és 360 mg (0,5 mmól) (Ic) képletű vegyületet használunk. A reakciót az 1. példa b) lépésében leírt módon végezzük. A nyers terméket 65 metanolban, Sephadex LH—20 gélen szűrjük. 297 mg 10
