170670. lajstromszámú szabadalom • Eljárás peptid-peptidohidroláz-típúsú proteolitikus enzimek mennyiségének meghatározására, és eljárás a reagensek előállítására
5 170670 6 vihetünk fel. A tirozin-egység hidroxil-csoportjának védelmére a peptid-kémiában általánosan alkalmazott hidroxil-védőcsoportokat, például benzil- vagy terc-butil-csoportot használhatunk. A peptid-lánc lépésenkénti szintézise során az egyes új aminosavak bevitele után kapott termékeket gélszűréssel is tisztíthatjuk. A tisztításhoz ismert gélszűrővel, például keresztkötéses dextrángéllel (Sephadex G vagy LH, a Pharmacie Fine Chemicals cég gyártmánya, Uppsala, Svédország) vagy vinilacetát-kopolimer géllel (például Merckogel OR—PVA, az E. Merck A. G. cég gyártmánya, Darmstadt, Német Szövetségi Köztársaság) töltött oszlopot alkalmazunk. A gélt egyensúlyba hozzuk a megfelelő oldószerrel (például metanollal, etanollal, acetonnal, dimetilformamiddal, dimetilacetamiddal, dimetilszulfoxiddal, dimetilacetamiddal vagy hexametilfoszforsav-triamiddal), majd ugyanezzel az oldószerrel eluáljuk. A peptid-peptidohidroláz-típusú proteolitikus enzimek mennyiségének analitikai meghatározását a találmány értelmében úgy végezzük, hogy a vizsgálandó enzimet valamely (A) általános képletű vegyülettel — ahol az aminosavak konfigurációja, valamint Rj, R2 , R3 , R 4 , R 5 és n jelentése a fenti — vagy e vegyület savaddíciós sójával reagáltatjuk, a reakció során felszabaduló NH2 —R 5 általános képletű vegyület — ahol R5 jelentése a fenti — mennyiségét önmagában ismert fotometriás vagy spektrofotometriás módszerrel mérjük, és a mérési adatokból kiszámítjuk a peptid-peptidohidroláz-típusú proteolitikus enzim mennyiségét. A találmány szerinti eljárást az oltalmi kör korlátozása nélkül az alábbi példákban részletesen ismertetjük. Az eluátum és a termékek vékonyrétegkromatográfiás vizsgálatához abszorpciós közegként szilikagél-réteggel (F 254, az E. A. G. Merck cég gyártmánya, Darmstadt, Német Szövetségi Köztársaság) bevont üveglemezt használtunk fel, míg futtatószerként az alábbi oldószerelegyeket alkalmaztuk: A: 3: 1: 1 arányú n-butanol: ecetsav: víz-elegy C: 7: 1:2 arányú n-propanol: etilacetát: víz-elegy D: 3:2: 1 arányú n-heptán: n-butanol — ecetsav-elegy Pt : 9: 1 arányú kloroform: metanol-elegy Futtatás után a lemezeket először 254 nm hullámhosszú ultraibolya fényben, majd klór/toluidin reakcióval (G. Pataki: Dünnschichtchromatografie in der Aminosäure und Peptid-Chemie, Walter de Gruyter and Co., Berlin, 1966. 125. oldal) hívtuk elő. Amennyiben egyebet nem közlünk, a példákban említett aminosavak L-konfigurációjúak. A példákban a következő rövidítéseket használtuk: Arg = arginin Phe = fenilalanin lie = izoleucin Tyr = tirozin Leu = leucin Val = valin Lys=lizin C. Ph. Gly=C-fenil-Ac = acetil-csoport -glicin Ac2 OH =ecetsavanhidrid AcOH = ecetsav BOC = terc-butoxikarbonil-csoport Bz = benzoil-csoport Bzl = benzil-csoport Bz2 0 = benzoesavanhidrid Cbo benziloxikarbonil-csoport DCCI = diciklohexil-karbodiimid DCHA = diciklohexil-amin DCU = diciklohexil-karbamid DMF = dimetilformamid Et3 N = trietilamin 5 HMPTA = N,N,N',N',N' ',N' '-hexametil-foszforsav-triamid MCbo = p-metoxi-fenil-azo-benziloxikarbonil-csoport MeOH= metanol NA = naftilamin 10 OtBu = terc-butoxi-csoport OEt = etoxi-csoport OMe = metoxi-csoport OpNP =p-nitro-fenoxi-csoport OizoPr = izopropoxi-csoport 15 pNA = p-nitro-anilid-csoport p-Me-Be = p-metil-benzoil-csoport TFA = trifluoracetil-csoport Tos = 4-toluolszulfonil-csoport A gélszűréshez Sephadex G—15 és G—25 gélt hasz-20 náltunk fel. Mindkét anyag keresztkötéses dextrángél, amelyek a térhálósság fokában különböznek egymástól. A példákban említett Sephadex LH—20 gél hidroxipropilezett keresztkötéses dextrángél. A Sephadex megjelölésű gélek a Pharmacia Fine Chemicals cég (Uppsala, 25 Svédország) termékei. 1. példa 30 N«-Bz-Phe-Val-Arg-pNA • HCl (I) a) lépés: Cbo-Arg(N02)-pNA (la) 1.35,3 g (0,1 mól) vízmentes Cbo-Arg(NQ2)-OH-t 35 200 ml frissen desztillált, vízmentes HMPTA-ban oldunk szobahőmérsékleten, majd az oldathoz keverés közben, a nedvesség kizárásával 10,1 g (0,1 mól) Et3 N-t és 24,6 g (0,15 mól) p-nitro-fenil-izocianátot adunk. Az elegyet 24 órán át szobahőmérsékleten tart-40 juk, majd keverés közben 2 liter 2%-os vizes nátríumhidrogénkarbonát-oldatba öntjük. A kivált csapadékot leszűrjük, 3 X 0,5 liter 2%-os vizes nátriumhidrogénkarbonát-oldattal, 2 X0,2 liter desztillált vízzel, 2 X0,5 liter 0,5 n vizes sósavoldattal, végül 5 X0,2 liter desz-45 tillált vízzel mossuk, majd szárítjuk. A nyers terméket meleg metanollal extraháljuk. Az oldószer kevés melléktermék mellett kvantitatíve kioldja a kívánt terméket. Az N,N'-bisz-p-nitro-fenil-karbamidból álló oldhatatlan maradékot kiszűrjük, és a szűrletet metanollal 50 egyensúlyba hozott Sephadex LH—20 géllel töltött oszlopon kromatografáljuk. Eluálószerként metanolt használunk. 29,8 g (63,0%) (la) képletű vegyületet kapunk, amely vékonyrétegkromatográfiásan (futtatószer: PL illetve C elegy) egységes. Op.: 185—188 C°, [<x]£ = 55 = —1,3° (c = 1,1, ecetsavban). 2. 35,3 g (0,1 mól) vízmentes Cbo-Arg(N02 )-OH-t 600 ml 1: 1 arányú tetrahidrofurán: DMF elegyben oldunk, és az oldathoz 10,1 g (0,1 mól) Et3 N-t adunk. Az oldatot a nedvesség kizárásával —10 C°-ra hűtjük, 60 majd 10 perc alatt 13,7 g (0,1 mól) klórhangyasav-izobutilészter 50 ml tetrahidrofuránnal készített oldatát csepegtetjük az elegybe. Az elegyhez 10 perc elteltével 16,4 g (0,1 mól) p-nitro-anilint adunk. Az elegyet szobahőmérsékletre hagyjuk melegedni, 24 órán át szoba-65 hőmérsékleten tartjuk, majd az oldószert vákuumban 3
