170670. lajstromszámú szabadalom • Eljárás peptid-peptidohidroláz-típúsú proteolitikus enzimek mennyiségének meghatározására, és eljárás a reagensek előállítására
7 170670 8 lepároljuk. A maradékot desztillált vízzel és 5%-os vizes nátriumhidrogénkarbonát-oldattal, majd ismét desztillált vízzel eldörzsöljük (az eldörzsölést egy-egy anyaggal 3—5-ször végezzük), végül vákuumban szárítjuk. A nyers terméket metanolból kétszer átkristályosítjuk. Az anyalúgot metanollal egyensúlyba hozott Sephadex LH—20 gélen szűrjük. 23,0 g (48,5%) (la) képletű vegyületet kapunk, amelynek fizikai állandói azonosak a fent ismertetettekkel. 3. 35,3 g (0,1 mól) Cbo-Arg(N02 )-OH-t DMF-ban oldunk, az oldatot —10 C°-ra hűtjük, majd az elegyhez 20,6 g (0,1 mól) DCCI-t és 16,4 g (0,1 mól) p-nitro-anilint adunk. Az elegyet 24 órán át szobahőmérsékleten tartjuk, ezután vákuumban szárazra pároljuk, és a maradékot desztillált vízzel, 5%-os vizes nátriumhidrogénkarbonát-oldattal, desztillált vízzel, 0,5 n vizes sósavoldattal, végül ismét desztillált vízzel 3—5-ször eldörzsöljük. A maradékot vákuumban szárítjuk. A nyers terméket metanollal egyensúlyba hozott Sephadex LH—20 gélen szűrjük. 14,7 g (34,0%) (la) képletű vegyületet kapunk. A termék vékonyrétegkromatográfiásán (futtatószer: P1; illetve C elegy) egységes. Op.: 186—188 C°, Mg1 = -1,38° (c-1,0, ecetsavban). b) lépés: Cbo-Val-Arg(N02 )-pNA (Ib) 20,6 g (43,5 mmól) (la) képletű vegyület, 110 ml ecetsav és 110 ml 4 n ecetsavas brómhidrogénsav-oldat elegyét 60 percig a nedvesség kizárásával szobahőmérsékleten keverjük. Ezután az elegyet lassú ütemben, erélyes keverés közben 750 ml vízmentes éterbe öntjük. H-Arg(NC>2)-pNA -1,5 HBr válik ki. Az éteres fázist dekantálással elválasztjuk, a maradékot az ecetsav-és brómhidrogénsav fölösleg és a benzilbromid melléktermék eltávolítása céljából 4 X 250 ml vízmentes éterrel mossuk, majd vákuumban foszforpentoxid fölött szárítjuk. A terméket kvantitatív hozammal (20,0 g) kapjuk. 20,0 g (43,5 mmól) H-ArgtNO^-pNA • 1,5 HBr-t 150 ml DMF-ban oldunk, és az oldathoz 10 C°-on 6,60 g (65,2 mmól) Et3 N-t adunk. A kivált Et 3 N • HBr-t kiszűrjük, és a szűrlethez — 10 C°-on 20,3 g (54,3 mmól) Cbo-Val-OpNP-t adunk. A reakcióelegyet néhány órán át szobahőmérsékletre hagyjuk melegedni, majd ismét lehűtjük, és 2,2 g (21,7 mmól) Et3 N-t adunk hozzá. Körülbelül 3 óra elteltével az elegyhez ismét Et3 N-t adunk. Összesen 24 óra reakcióidő elteltével a reakcióelegyet vákuumban 40 C°-on szárazra pároljuk, a maradékot 3 X 100 ml desztillált vízzel eldörzsöljük, majd vákuumban szárítjuk. A kapott nyers terméket metanolból kétszer átkristályosítjuk. 12,4 g (50%) tiszta terméket kapunk. Az anyalúgot metanollal egyensúlyba hozott Sephadex LH—20 gélen szűrjük. Az eluátumból további 10,8 g tiszta terméket különítünk el. c) lépés: Cbo-Phe-Val-Arg(NÖ2 )-pNA (Ic) Kiindulási anyaként 28,6 g (50 mmól) (Ib) képletű vegyületet és 31,5 g (75 mmól) Cbo-Phe-OpNP-t használunk. A reakciót az 1. példa b) lépésében leírt módon végezzük. A kapott nyers terméket metanolból háromszor átkristályosítjuk. 14,4 g tiszta terméket kapunk, amely vékonyrétegkromatográfiásan (futtatószer: Pj elegy) egységes. Az anyalúgot metanollal egyensúlyba hozott 5 Sephadex LH—20 gélen szűrjük. Az eluátumból további 19,6 g terméket kapunk, amely vékonyrétegkromatográfiásán (futtatószer: Pl elegy) egységes. Összesen 34,0 g (94,4%) tiszta, vékonyrétegkromatográfiásan (futtatószer: Pt elegy) egységes (íc) képletű 10 vegyületet kapunk. Op.: 219,5—222 C°; [a]g = - 17,1° (c = 1,0, 99: 1 arányú DMF: AcOH elegyben). d lépés: Na -Bz-Phe-Val-Arg(N0 2 )-OMe (Id) 15 Kiindulási anyagként 30,7 g (50 mmól) Cbo-Phe-Val-Arg(N02 )-OMe-t és 16,0 g (75 mmól) Bz 2 0-t használunk fel. A Cbo-Phe-Val-Arg(N02 )-OMe benziloxikarbonil-csoportját az 1. példa b) lépésében leírt módon hasít -20 jukle. 30,0 g (50 mmól) H-Phe-Val-Arg(N02 )OMe • 1,5 HBr 350 ml DMF-dal készített oldatához -10 C°-on 7,6 g (75 mmól) Et3 N-t adunk. A reakcióelegyet 1 órán át a nedvesség kizárásával keverjük, majd a kivált 25 Et3 N • HBr-t kiszűrjük. A szűrlethez - 10 C°-on 16,0 g (75 mmól) Bz2 Ö-t adunk. Körülbelül 3 óra elteltével, amikor a reakcióelegy szobahőmérsékletre melegedett, az elegyet ismét lehűtjük, és 2,5 g (25 mmól) Et3 N-t adunk hozzá. Körülbelül 3 óra elteltével az elegyhez 30 ismét Et3 N-t adunk. Összesen 24 órás reakcióidő után az elegyet vákuumban bepároljuk. A maradékot az 1. példa b) lépésében leírt módon dolgozzuk fel. A terméket metanollal egyensúlyba hozott Sephadex LH—20 gélen végzett szűréssel tisztítjuk. 35 26,0 g (88,9%) (Id) képletű vegyületet kapunk, amely vékonyrétegkromatográfiásan (futtatószer: P2, illetve D elegy) egységes. Op.: 138—141 C°, MD = -39,8° (c = 1, metanolban). 40 e) lépés: Na -Bz-Phe-Val-Arg(N0 2 )-OH (le) 11,7 g (20 mmól) (Id) képletű vegyület 200 ml 50%-os etanollal készített oldatához 200 ml etanolos (95%) 1 n káliumhidroxid-oldatot adunk. Az elegyet 75 percig szobahőmérsékleten keverjük, majd az oldatba 7-es 45 pH-érték eléréséig széndioxid-gázt vezetünk. Az oldatot vákuumban körülbelül 25 ml végtérfogatra bepároljuk, majd vízzel 500 ml-re hígítjuk. Az oldatot etilacetáttal négyszer extraháljuk, majd a vizes fázist sósavoldattal pH = 2,8 értékre savanyítjuk. A kivált csapadékot le-50 szűrjük, desztillált vízzel többször mossuk, és vákuumban szárítjuk. A nyers terméket metanolból kétszer átkristályosítjuk. Az anyalúgot metanollal egyensúlyba hozott Sephadex LH—20 gélen szűrjük. 55 10,1 g (88,5%) amorf (le) képletű vegyületet kapunk. A termék vékonyrétegkromatográfiásan (futtatószer: A, illetve C elegy) egységes, és mólsúlya 555,7. /; lépés: N a-Bz-Phe-Val-Arg(N0 2 )-pNA (If) 60 1. Kiindulási anyagként 7,2 g (10 mmól) (Ic) képletű vegyületet és 3,4 g (15 mmól) Bz2 0-t alkalmazunk. A reakciót az 1. példa b) lépésében leírt módon végezzük. A terméket metanollal egyensúlyba hozott Sepha-65 dex LH—20 gélen szűrjük. 4
