170670. lajstromszámú szabadalom • Eljárás peptid-peptidohidroláz-típúsú proteolitikus enzimek mennyiségének meghatározására, és eljárás a reagensek előállítására
31 170670 32 6. táblázat PLAZMIN-AKTIVITÁS Reagens Reagens konc. Enzim konc. Képződött (példa) nmól/ml CU/ml p-nitro-anilin nmól/percXml 1. 66,7 0,167 5,6 5. 66,2 0,167 6,2 6. 67,4 0,167 4,1 8. 65,4 0,167 7,6 9. 66,4 0,167 3,4 10. 58,2 0,167 2,7 11. 65,1 0,167 4,7 18. 66,9 0,167 5,3 19. 66,2 0,167 2,1 20. 67,6 0,167 2,1 21. 65,6 0,167 3,4 22. 65,7 0,167 2,2 23. 67,1 0,167 5,4 24. 66,6 0,167 2,5 25. 66,4 0,167 4,3 26. 64,7 0,167 6,2 32. 69,0 0,167 5,7 5.táblázat REPTILASE-AKTIVITÁS Reagens Reagens konc. Enzim konc. Képződött (példa) nmól/ml egység/ml p-nitro-anilin nmól/percXml 1. 66,7 0,5 4,4 2. 66,7 0,5 3,0 13. 66,7 0,5 4,6 15. 66,7 0,5 2,2 A táblázatok adataiból világosan látható, hogy a találmány szerint előállított reagensek lényegesen előnyösebbek a tripszin vizsgálatára eddig felhasznált BAPNA megjelölésű amid-reagensnél. Az új reagensek fokozott érzékenységük következtében kismennyiségű enzim meghatározását is lehetővé teszik anélkül, hogy a meghatározás pontossága csökkenne. Klinikai szempontból ez igen fontos előny, minthogy így a meghatározáshoz kevesebb biológiai eredetű mintára van szükség. A vér koagulálása igen bonyolult folyamat. A koagulálás során a trombin enzimes úton szabályozza a fibrinogen fibrinné alakulását. A vér egyéb koagulációs faktorainak nagy része ugyancsak reagál trombinnal. A találmány szerint előállított reagensekkel lehetővé válik e koagulációs faktorok meghatározása. A következőkben az antitrombin meghatározását ismertetjük. Az antitrombin meghatározásának elve a következő: plazmamintához ismert mennyiségű (fölöslegben vett) trombint adunk; ekkor a vérben levő szabad antitrombin a beadagolt trombinhoz kapcsolódik. A találmány szerint előállított reagenssel meghatározzuk a trombin maradékát, és a kapott eredményből kiszámítjuk a reagált antitrombin mennyiségét. Antitrombin meghatározása Vénás vért fíbrinogén-mentesítünk és centrifugálunk. 0,5 ml vérplazmát elkülönítünk, és 2 ml trisz-imidazolpufferoldattal hígítjuk. 0,25 ml így kapott plazmaoldat és 0,1 ml (10 NIH-egység) vizes trombin-oldat elegyét pontosan 5 percig 37—40 C°-on inkubáljuk. Az elegyhez 1 ml előmelegített pufferoldatot és 0,25 ml 1 mg/ml koncentrációjú vizes enzim-szubsztrátum oldatot adunk, 5 és a kapott elegyet pontosan 1 percig 37—40 C°-on inkubáljuk. A reakciót ezután 0,25 ml tömény ecetsav beadagolásával leállítjuk, és az elegy 405 nm hullámhosszhoz tartozó extinkcióját spektrofotométeren leolvassuk. Szabadalmi igénypontok 1. Eljárás peptid-peptidohidroláz-típusú proteolitikus 15 enzimek mennyiségének meghatározására, azzal jellemezve, hogy a vizsgálandó enzimet valamely (A) általános képletű, kromofór csoportot tartalmazó, tripeptidtípusú diagnosztikai reagenssel — ahol Rj hidrogénatomot, 1—12 szénatomos alkanoil-csopor-20 tot, 1—9 szénatomos to-amino-alkanoil-csoportot, ciklohexil-karbonil-csoportot, o)-ciklohexil-(l—5 szénatomos)-alkanoil-csoportot, 4-aminometil-ciklohexilkarbonil-csoportot, helyettesítetlen vagy adott esetben egy vagy több metil- vagy amino-csoporttal 25 helyettesített benzoil-csoportot, w-fenil-(l—6 szénatomos)-alkanoil-csoportot,w-aminofenil-(l—4szénatomos)-alkanoil-csoportot, 4-toluolszulfonil-csoportot, fenilalanil-csoportot vagy N"-benzoil-fenilalanil-csoportot jelent, 30 R2 fenil-, benzil- vagy 4-hidroxi-benzil-csoportot jelent, R3 elágazó szénláncú, 3—-5 szénatomos alkil-csoportot jelent, n értéke 3 vagy 4, R4 hidrogénatomot vagy amidino-csoportot jelent, 35 R5 nitrofenil-, naftil- vagy nitronaftil-csoportot jelent, és a jelenlevő aminosavak D, L vagy DL-konfigurációjúak — vagy e reagens savaddíciós sójával reagáltatjuk, a reakció során felszabaduló NH2 —R 5 általános képletű vegyület — ahol R5 jelentése a fenti — mennyiségét 40 önmagában ismert fotometriás vagy spektrofotometriás módszerrel mérjük, és a mérési adatokból kiszámítjuk a peptid-peptidohidroláz-típusú proteolitikus enzim mennyiségét. (Elsőbbsége: 1973. április 28.) 2. Eljárás peptid-peptidohidroláz-típusú proteolitikus 45 enzimek mennyiségének meghatározására, azzal jellemezve, hogy a vizsgálandó enzimet valamely (A) általános képletű, kromofór csoportot tartalmazó, tripeptidtípusú diagnosztikai reagenssel — ahol Rj hidrogénatomot, 1—12 szénatomos alkanoil-csopor-50 tot, 1—9 szénatomos w-amino-alkanoil-csoportot, ciklohexil-karbonil-csoportot, co-ciklohexil-(l—5 szénatomos)-alkanoil-csoportot, 4-aminometil-ciklohexilkarbonil-csoportot, helyettesítetlen vagy adott esetben egy vagy több metil- vagy amino-csoporttal 55 helyettesített benzoil-csoportot, co-fenil-(l—6 szénatomos)-alkanoil-csoportot, co-aminofenil-(l—4 szénatomos)-alkanoil-csoportot, 4-toluolszulfonil-csoportot, fenilalanil-csoportot vagy Na -benzoil-fenilalalnil-csoportot jelent, 60 R2 fenil-, benzil- vagy 4-hidroxi-benzil-csoportot jelent, R3 elágazó szénláncú, 3—5 szénatomos alkil-csoportot jelent, n értéke 3 vagy 4, R4 hidrogénatomot vagy amidino-csoportot jelent, 65 R5 nitrofenil-, naftil- vagy nitronaftil-csoportot jelent, 16
