170670. lajstromszámú szabadalom • Eljárás peptid-peptidohidroláz-típúsú proteolitikus enzimek mennyiségének meghatározására, és eljárás a reagensek előállítására
29 170670 30 Ha az összes E csoport S csoporthoz kapcsolódik, (ES)-(E), következésképpen 2. táblázat TRIPSZIN-AKTIVITÁS Reagens (példa) Reagens konc. nmól/1 Enzim konc NIH/ml Km Xl0' mól/l ti ? BAPNA 1. 2. .8. 12. 255—666 19,0— 88,2 28,2— 94,0. 19,0— 88,2 31,8—106,0 75 3 3 3 3 16 0,31 1,01 0,31 0,89 8,3 110 112 98 60 3. táblázat TROMBIN-AKTIV1TÁS Reagens Reagens Enzim konc. Képződött p(példa) konc. nmól/ml NIH/ml -nitro-anilin nmól/percXml BAPNA 333,0 50,0 1,04 1. 64,6 0,417 6,0 6. 67,4 0,417 0,3 8. 65,4 0,417 2,7 9. 66,4 0,417 0,5 10. 58,2 0,417 1,7 11. 65,1 0,417 0,2 18. 66,9 0,417 5,6 19. 66,2 0,417 0,3 20. 67,6 0,417 0,2 21. 65,6 0,417 1,7 22. 65,7 0,417 2,0 24. 66,6 0,417 0,4 25. 66,4 0,417 0,6 26. 64,7 0,417 1,4 32. 69,0 0,417 0,1 4. táblázat TRIPSZIN-AKTIVITÁS Reagens Reagens konc. Enzim konc. Képződött (példa) nmól/ml egység/ml p-nitro-anilin nmól/percXml BAPNA 333,0 2,08 6,1 1. 66,7 0,0833 16,3 5. 66,2 0,0833 12,9 6. 67,4 0,0833 11,1 8. 65,4 0,0083 13,7 9. 66,4 0,0833 6,8 10. 58,2 0,0833 13,1 11. 65,1 0,0833 1,6 18. 66,9 0,0833 14,1 19. 66,2 0,0833 5,5 20. 67,6 0,0833 6,2 21. 65,6 0,0833 14,0 22. 65,7 0,0833 6,2 23. 67,1 0,0833 5,9 24. 66,6 0,0833 6,2 25. 66,4 0,0833 10,9 26. 64,7 0,0833 23,7 32. 69,0 0,0833 2,9 v=vmax =k 3 .(E) (3) A Linewaver-Burk egyenletet bevezetve: 1 Km 1 1 -= .-+ (4) * "max vV-' vma\ Amint a (2) egyenletből látható, a reagens egy adott 10 enzimre vonatkoztatott hatékonyságát a Km és k 3 állandók határozzák meg. E két állandót a következőképpen határozzuk meg: az enzimet és a reagenst pufferoldatban elegyítjük egymással, és 5 percen át spektrofotometriás úton követjük a reakciót. A reagens (S) koncentrációja 15 változik, míg az enzim (E) koncentrációját minden egyes reagensnél állandó értéken tartjuk. Az extinkciót (OD) az idő függvényében ábrázoljuk (OD/t). Az így kapott görbéből meghatározzuk a nulla időponthoz tartozó tangens-értéket [ = percenkénti extinkciókülönbség, 20 AOD/perc, amelyből kiszámítható a percenként képződött p-nitro-anilin mennyisége (v, (imól)], amely a kezdeti reakciósebességet (v) adja. Az 1/v értéket 1/(S) függvényében ábrázoljuk, és a kapott diagramból meghatározzuk a (4) egyenletben szereplő K^ és vmax érté- 25 keket. A trombinra és különböző reagensekre vonatkozó Km és k 3 [=v max /(E)] értékeket az 1. táblázatban, a tripszinre vonatkozó megfelelő értékeket a 2. táblázatban közöljük. Egyes enzim-reagens párok esetén a táblázat nem tartalmazza a Km és k 3 értékeket. Ez azt 30 jelenti, hogy ezeket az értékeket nem határoztuk meg, vagy ezek az értékek nem számíthatók, mert 1/v és 1/(S) között nincs lineáris összefüggés. Az egyes enzim-reagens párok reakcióit közelítően úgy értékelhetjük, hogy összehasonlítjuk az azonos 35 reagens-koncentráció esetén percenként és milliliterenként képződő p-nitro-anilin mennyiségét. Ezeket az értékeket a 3. táblázatban trombinra, a 4. táblázatban tripszinre, az 5. táblázatban Reptilase enzimre (Bothrops Atrox-ból elkülönített, trombin-szerű hatással rendelke- 40 ző enzim) és a 6. táblázatban plazminra adjuk meg. Az 1. példa szerint előállított reagens trombinnal végbemenő amidolízisének optimális körülményei a következők: pH =8,2, ionerősség =0,13—0,15, hőmérséklet = 37—40 C°. 45 A NIH jelölés „National Institute of HealtiY'-egységet jelent. A „tripszin-egység" azt az enzim-mennyiséget jelenti, amelynek hatására 25 C°-on, 8,1 pH-értéken, 0,01 mól kalcium-ion jelenlétében 1 perc alatt 1 [xmól NMozil-arginin-metilészter-hidroklorid (TAME) hidro- 50 lizál el. A tripszint a Worthington Biochemical Corporation cégtől (Freehold, N. J., Amerikai Egyesült Államok) szereztük be, a plazmin saját gyártmány. 1 mg plazmin 3 kazein-egységnek (CU) felel meg. 55 1. táblázat TROMBIN-AKTIVITÁS Reagens Enzim Km X10' k,X104 (példa) konc. [unól/l konc. NIH/ml nmól/1 (zmól/perc, NIH/ml BAPNA 250—666 50 6 11 1. 19,3— 89,6 0,5 1,62 1340 2. 28,2— 94,0 5 0,8 50 8. 19,3— 89,6 0,5 0,55 360 12. 31,8—106,0 5 3,91 110 15
