170670. lajstromszámú szabadalom • Eljárás peptid-peptidohidroláz-típúsú proteolitikus enzimek mennyiségének meghatározására, és eljárás a reagensek előállítására
27 170670 28 gyet néhány óra alatt szobahőmérsékletre hagyjuk melegedni, majd ismét lehűtjük, és 0,31 ml (2,2 mmól) Et3 N-t adunk hozzá. 2 óra elteltével az Et3 N adagolását megismételjük. Összesen 24 órás reakcióidő után az elegyet vákuumban, körülbelül 40 °C-on szárazra pároljuk. 5 A maradékot 3 X 20 ml desztillált vízzel eldörzsöljük, és vákuumban szárítjuk. A nyers terméket metanolban oldjuk; és metanollal egyensúlyba hozott Sephadex LH—20 gélen kromatografáljuk. Eluálószerként metanolt használunk. A vég- 10 termék 80%-át tartalmazó eluátumfrakcióból 2,12 g (80,3%) (XXXIIb) képletű vegyületet különítünk el. A termék vékonyrétegkromatográfiásan (futtatószer: Pt, illetve C elegy) egységes. [OC]D = —1,9° (c = l,0, dimetilformamidban). 15 c) lépés: BOC-Phe-Val-Lys(s-Cbo)-pNA (XXXIIc) Kiindulási anyagként 0,85 g (1,42 mmól) (XXXIIb) képletű vegyületet és 0,77 g (2,0 mmól) BOC-Phe-OpNP-t használunk. A reakciót a 32. példa b) lépésé- 20 ben leírt módon végezzük. A nyers terméket metanolban, Sephadex LH—20 gélen szűrjük. 0,84 g (79,3%) amorf (XXXIIc) képletű vegyületet kapunk, amely vékonyrétegkromatográfiásan (futtatószer: Pj elegy) egységes. [ct]g = — 9,3° (c = 1,02, dimetilformamidban). 25 d) lépés: N-Bz-Phe-Val-Lys(e-Cbo)-pNA (XXXIId) Kiindulási anyagként 600 mg (0,804 mmól) (XXXIIc) képletű vegyületet és 280 mg (1,25 mmól) Bz2 0-t használunk. A védőcsoport lehasítását a 32. példa b) lé- 30 pésében leírt módon végezzük. 608 mg CF3 COOH.H-Phe-Val-Lys(s-Cbo)-pNA-t 10 ml dimetilformamidban oldunk, és az oldathoz — 10 C°-on 113 ml (0,8 mmól) Et3 N-t adunk. Az elegyhez ezután — 10 C°-on 280 mg (1,25 mmól) Bz2 0-t adunk, majd az elegyet a 32. példa 35 b) lépésében leírt módon pufferoljuk. A nyers terméket metanolos oldatban Sephadex LH—20 gélen szűrjük. 460 mg (XXXIId) képletű vegyületet kapunk, amely vékonyrétegkromatográfiásan (futtatószer: Pj, illetve C elegy) egységes. [<xjg = -22,8° (c=0,99, dimétil- 40 formamidban). e) lépés: N a-Bz-Phe-Val-Lys-pNA .HCl (XXXII) Kiindulási anyagként 280 mg (0,373 mmól) (XXXIId) képletű vegyületet használunk. A reakciót az 1. példa 45 g) lépésében leírt módon végezzük. A nyers terméket 50%-os ecetsavban Sephadex G—15 gélen szűrjük. Az eluátumot fagyasztva szárítjuk. 172 g (71%) amorf, 5,39% klórtartalmú (XXXII) képletű vegyületet kapunk, amely vékonyrétegkromatográfiásan (futtatószer: 50 A elegy) egységes, [aß2 = -36,2° (c=0,67, 50%-os ecetsavban). Aminosav-elemzés eredménye: Val: 1,0; Phe:0,9;Lys:l,l. A példák szerint előállított reagenseket a következőképpen használjuk fel enzimek meghatározására: 55 Az egyik meghatározási módszer — amelyet a későbbiekben részletesen ismertetünk — azon alapul, hogy az (A) általános képletű reagensekből enzimes hidrolízis hatására képződő termék ultraibolya abszorpciós spektruma teljes mértékben eltér a kiindulási reagensétől. 60 Az enzimes hidrolízis hatására lehasadó NH2 —R 5 általános képletű vegyületek — ahol R5 jelentése a fenti — 405 nm hullámhossznál jól mérhetők; ezen a hullámhosszon az alapreagensek abszorpciója jelentéktelen. Egy további eljárásmód szerint az enzimes hidrolízis 65 hatására lehasadó NH2 —R 5 általános képletű vegyületekből —• ahol R5 jelentése a fenti — diazotálással, majd azt követő kapcsolási reakcióval (kapcsolódó reagensként például N-(ß-naftil)-etilendiamint használhatunk fel) azoszinezéket képezünk, és a képződött azoszínezék mennyiségét fotometriás úton mérjük. Eljárhatunk úgy is, hogy az enzimes hidrolízis hatására lehasadó NH2 —R 5 általános képletű vegyületek mennyiségét közvetlen fotometriás méréssel határozzuk meg. Ez a módszer az R5 helyén nitrofenil- vagy nitronaftil-csoportot tartalmazó vegyületek esetén alkalmazható. Az R5 helyén naftil-csoportot tartalmazó (A) általános képletű peptidekből enzimes hidrolízis hatására lehasadó naftilamin mennyiségét fluoreszcencia-spektrofotometriás úton mérhetjük. A következőkben az ultraibolya abszorpciós spektrum felvételével végzett elemzési módszert részletesen ismertetjük. Példaként azNa -Bz-Phe-Val-Arg-pNA.HCl (az 1. példa szerint előállított reagens) felhasználásával végzett elemzést írjuk le; ugyanez az elemzési módszer azonban valamennyi egyéb reagens felhasználásával is végrehajtható. Az 1. példa szerint előállított reagens ultraibolya abszorpciós spektrumában X = 303 nm-nél jelenik meg maximum (s = 12 900), és 405 nm hullámhosszon a reagens abszorpciója jelentéktelen. A reagensből enzimes hidrolízis hatására képződő p-nitro-anilin (pNA) abszorpciós maximuma 380 nm-nél jelentkezik (moláris extinkciós koefficiens: 13 200), és a moláris extinkciós koefficiens 405 nm hullámhosszon csak 9620-ra csökken. Ennek megfelelően az enzimes hidrolízis mértékét — amely arányos a képződött p-nitro-anilin mennyiségével — 405 nm hullámhosszon végzett spektrofotometriás méréssel igen könnyen követhetjük. A reagens fölöslege az adott hullámhosszon nem zavarja a meghatározást. Az enzimes reakciót a következő egyenlettel írhatjuk le: E+S =t. ES— ES' + kromofór Pt I E+P2 Az egyes betűjelzések jelentése a következő: E = enzim S = reagens ES = enzim-reagens komplex Pl és P2 = termékek kj, k2 , k 3 és k 4 = sebességi állandók Az ES komplex disszociáció-állandója: k2 — = Km (Michaelis-állandó) ki Ha (S)»(E) és k4 <sck 3 , a következő egyenlet érvényes: [(E)- (ES)]. (S) Km = (1) (ES) A P! kromofór termék képződési sebessége: v = k3 .(ES), azaz k3 .(E).(S) v= (2) Km + (S) 14
