170670. lajstromszámú szabadalom • Eljárás peptid-peptidohidroláz-típúsú proteolitikus enzimek mennyiségének meghatározására, és eljárás a reagensek előállítására
170670 25 26 d) lépés: N«-Bz-Phe-Val-Arg(N02)-l-N0 2 -2-NA (XXX) Kiindulási anyagként 680 mg (0,88 mmol) (XXXb) képletű vegyületet és 260 mg (1,15 mmól) Bz20-t használunk. A reakciót az 1. példa d) lépésében leírt módon végezzük. A nyers terméket metanolban, Sephadex LH—20 gélen szűrjük. 480 mg (73%) amorf (XXXd) képletű vegyületet kapunk, amely vékonyrétegkromatográfiásan (futtatószer: P, elegy) egységes, [a]^ = -31,4° (c =0,9, dimetilformamidban). e) lépés: N«-Bz-Phe-Val-Arg-l-NOr 2-NA.HCl (XXX) Kiindulási anyagként 480 mg (0,65 mmól) (XXXd) képletű vegyületet használunk. A reakciót az 1. példa g) lépésében leírt módon végezzük. A nyers terméket 33%-os ecetsavban, Sephadex G—15 gélen szűrjük. A szűrletet fagyasztva szárítjuk. 268 mg (57%) amorf, 4,80% klórtartalmú (XXX) képletű vegyületet kapunk, amely vékonyrétegkromatográfiásan (futtatószer: A elegy) egységes. [a]g = -39,7° (c =0,73, 50%-os ecetsavban). 31. példa Na -Bz-Phe-Val-Arg-4-NO r l-NA . HCl (XXXI) a) lépés: Cbo-Arg(N02 )-4-N0 2 -l-NA (XXXIa) Kiindulási anyagként 3,6 g (10 mmól) Cbo-Arg(N02 )-OH-t és 2,26 g (12 mmól) 4-nitro-l-naftilamint használunk. A reakciót az 1. példa a-2). lépése szerint végezzük. A nyers terméket metanolban, Sephadex LH—20 gélen szűrjük. 3,61 g (60%) részben kristályos (XXXIa) képletű vegyületet kapunk, amely vékonyrétegkromatográfiásan (futtatószer: Px elegy) egységes. [<X]D = — 11,4° (c = 1,01, dimetilformamidban). b) lépés: Cbo-Val-Arg(N02 )-4-N0 2 -l-NA (XXXIb) Kiindulási anyagként 650 mg (1,23 mmól) (XXXIa) képletű vegyületet és 550 mg (1,45 mmól) Cbo-Val-OpNP-t használunk. A reakciót az 1. példa b) lépésében leírt módon végezzük. A nyers terméket metanolban, Sephadex LH—20 gélen szűrjük. 460 mg (60%) amorf (XXXIb) képletű vegyületet kapunk, amely vékonyrétegkromatográfiásán (futtatószer: P x elegy) egységes, [a]" = + 0,9° (c =0,55, dimetilformamidban). c) lépés: Cbo-Phe-Val-Arg(N02 )-4-N0 2 -l-NA (XXXIc) Kiindulási anyagként 450 mg (0,72 mmól) (XXXIb) képletű vegyületet és 365 mg (0,86 mmól) Cbo-Phe-OpNP-t használunk. A reakciót az 1. példa c) lépésében leírt módon végezzük. A nyers terméket metanolban, Sephadex LH—20 gélen szűrjük. 500 mg (90%) részben kristályos (XXXIc) képletű vegyületet kapunk, amely vékonyrétegkromatográfiásan (futtatószer: Pj elegy) egységes, [a.]^ = —6,0° (c = l,0, dimetilformamidban). d) lépés: N a-Bz-Phe-Val-Arg(N0 2 )-l-NA (XXXId) Kiindulási anyagként 490 mg (0,633 mmól) (XXXIc) képletű vegyületet és 180 mg (0,80 mmól) BzjO-t hasz-5 nálunk. A reakciót az 1. példa d) lépésében leírt módon végezzük. A nyers terméket metanolban, Sephadex LH—20 gélen szűrjük. 400 mg (84,7%) amorf (XXXId) képletű vegyületet kapunk, amely vékonyrétegkromatográfiásan (futtatószer: Pj elegy) egységes. [<x\o = 10 - 31,0° (c = 1,0, dimetilformamidban). e) lépés: Na -Bz-Phe-Val-Arg-4-N0 2 -l-NA.HCl (XXXI) 15 Kiindulási anyagként 380 mg (0,51 mmól) (XXXId) képletű vegyületet használunk fel. A reakciót az 1. példa g) lépésében leírt módon végezzük. A nyers terméket 50%-os ecetsavban, Sephadex G—15 gélen szűrjük. A szűrletet fagyasztva szárítjuk. 303 mg (81%) amorf, 20 4,79% klórtartalmú (XXXI) képletű vegyületet kapunk, amely vékonyrétegkromatográfiásan (futtatószer: A elegy) egységes. [a&2= -37,7° (c=0,74, 50%-os ecetsavban). Aminosav-elemzés eredménye: Val: 1,0; Phe: 1.1; Arg: 0,9. 32. példa Na -Bz-Phe-Val-Lys-pNA . HCl (XXXII) 30 a) lépés: N"-BOC-Lys(s-Cbo)-pNA (XXXIIa) 6,3 g (11,2 mmól) N«-BOC-Lys(e-Cbo)-OH-DCHA-t szobahőmérsékleten 40 ml vízmentes, frissen desztillált 35 HMPT A-ban oldunk, majd az oldathoz keverés közben, kis részletekben, a nedvesség kizárása mellett 5 g (30,5 mmól) p-nitro-fenil-izocianátot adunk. Az elegyet 24 órán át szobahőmérsékleten tartjuk, majd az 1. példa a) lépésében leírt módon feldolgozzuk. A reakcióban 40 melléktermékként metanolban rosszul oldódó N,N'-bisz-p-nitro-fenil-karbamid és N-p-nitro-fenil-N,N'diciklohexil-karbamid képződik. A nyers terméket metanollal egyensúlyba hozott Sephadex LH—20 gélen végzett gélszűréssel tisztítjuk. 4,17 g (74,5%) részben 45 kristályos, vékonyrétegkromatográfiásan (futtatószer: Pj elegy) egységes (XXXIIa) képletű vegyületet kapunk. [<xg = + 1,7° (c = 1,0, dimetilformamidban). b) lépés: N«-BOC-Val-Lys(s-Cbo)-pNA (XXXIIb) 50 10 ml frissen desztillált trifluorecetsav és 2,20 g (4,4 mmól) (XXXIIa) képletű vegyület elegyét 60 percig szobahőmérsékleten, nedvesség kizárásával keverjük, majd az elegyet erélyes keverés közben 150 ml vízmentes 55 éterbe öntjük. Olajos termékként CF3 CQOH.H-Lys(s-Cbo)-pNA válik ki, amely hűtés hatására megszilárdul. Az éteres fázist dekantálással elválasztjuk, és a csapadékot 3 X 75 ml vízmentes éterrel mossuk. Az éteres oldatokat elöntjük, és a szilárd anyagot vákuumban nát-60 riumhidroxid és foszforpentoxid fölött szárítjuk. 2,25 g (100%) CF3 COOH.H-Lys(e-Cbo)-pNA-t kapunk. 2,25 g (4,4 mmól) CF3 COOH.H-Lys(s-Cbo)-pNA 10 ml dimetilformamiddal készített oldatához —10 °C-on 0,75 ml (5,5 mmól) Et3 N-t adunk, majd az elegy-65 hez 2,0 g (5,5 mmól) BOC-Val-OpNP-t adunk. Az ele-13
