170670. lajstromszámú szabadalom • Eljárás peptid-peptidohidroláz-típúsú proteolitikus enzimek mennyiségének meghatározására, és eljárás a reagensek előállítására
3 170670 4 eddig ismert amid-reagenseknél lényegesen gyorsabban alakulnak át peptid-peptidohidrolázok hatására. A peptid-peptidohidrolázok csoportjába tartozó enzimek alapvető biológiai funkciója azonban — amint az nevükből is kitűnik — nem a természetes szubsztrátumok észterkötésének hasítása, hanem azok peptid- vagy amid-kötésének hidrolizálása. A szakirodalom szerint (Blood Clotting Enzymology, 36. és 42—44. oldal, Ed. Seegers W. H., Academic Press, 1967) a trombin észterolitikus és amidolitikus katalízis—reakciósebességének aránya különböző reakciókörülmények között nem állandó. Ezért szükség van olyan szintetikus amid-reagensekre, amelyek az eddig ismerteknél lényegesen érzékenyebbek a kérdéses enzimekre, és lényegesen gyorsabban bomlanak le mérhető vagy meghatározható termékekre. Az amid-reagensek különösen előnyösen alkalmazhatók az enzimes hidrolízis reakciómenetének követésére és tanulmányozására, minthogy ezek az anyagok a) kromofór termékeket képezhetnek, amelyek spektrofotometriás úton könnyen mérhetők és fényabszorpciós maximumuk nem esik egybe az eredeti amid-reagensekével, vagy b) fluoreszcens termékeket képezhetnek, amelyek fluoreszcencia-spektrofotometriás úton mérhetők, vagy c) olyan termékeket képezhetnek, amelyek megfelelő reagensekkel kapcsolva fotometriás úton nagy érzékenységgel mérhető anyagokat szolgáltatnak. A gyakorlatban már felhasználtak néhány hidrolizálható kromofór csoportot tartalmazó szintetikus amidreagenst. Ilyen reagenseket ismertet az Int. J. Peptide Protein Res. 4, 347 (1972) és 7, 91 (1975), valamint a Bull. Chem. Soc. Japan 43, 2900 (1970) közlemény. Az ismert reagensek túlnyomórészt N^-helyettesítetlen és Na-helyettesített mono-aminosav-p-nitro-analid-származékok és mono-aminosav-ß-naftilamid-szarmazekok. E vegyületek közül az Na-benzoil-DL-arginin-p-nitro-anilid-hidrokloridot (BAPNA) a tripszin (E.C.3.4.4.4.) meghatározására és a tripszin jelenlétében végbemenő reakciók követésére alkalmazzák. Ez a reagens az enzimes hidrolízis során kromofór termékként p-nitro-anilint képez, amely spektrofotometriás úton könnyen mérhető. Az ismert amid-szubsztrátumok specifitása és érzékenysége azonban nem megfelelő. A reagensek e hátrányos tulajdonsága következtében a meghatározáshoz viszonylag nagy mennyiségű biológiai eredetű anyagra van szükség, amelynek összegyűjtése gyakran nehézségekbe ütközik. További hátrányt jelent, hogy az enzimes reakció hosszú időt vesz igénybe, és a meghatározás pontossága nem kielégítő. Trombin meghatározására használható szintetikus amid-reagenst eddig még nem ismertettek. A BAPNA például, amelyet elsősorban tripszin meghatározására használnak fel, trombin meghatározására nem nagyon alkalmas, mert erre az enzimre csak kevéssé érzékeny, és a reakció nem követi a Michaelis—Menten kinetikát. Meglepő módon azt tapasztaltuk, hogy az (A) általános képletű új reagensek és azok savaddíciós sói peptid-peptidohidrolázokkal szemben rendkívül érzékenyek. A képletben Rj, R2 , R 3 , n, R 4 és R 5 jelenléte, valamint az aminosavak konfigurációja azonos a korábban közöltekkel. Az (A) általános képletű új vegyületeket a találmány értelmében úgy állíthatjuk elő, hogy a megfelelő, adott esetben védőcsoporttal ellátott aminosavakat, karbonsavakat, aminokat vagy peptid-fragmenseket önmagában ismert módon a helyes sorrendben összekapcsoljuk egymással, az adott esetben jelenlevő védőcsoportokat lehasítjuk, és a megfelelő aminosavat, peptid-fragmenst 5 vagy peptidet a szintézis tetszés szerinti lépésében hexametilfoszforsav-triamidban valamely OCN—R5 általános képletű vegyülettel reagáltatjuk — ahol R5 jelentése a fenti —, vagy a megfelelő aminosavat, peptid-fragmenst vagy peptidet a szintézis tetszés szerinti lé-10 pésében vegyes anhidriddé alakítjuk, és az így kapott vegyes anhidridet valamely NH2 —R5 általános képletű vegyülettel reagáltatjuk — ahol R5 jelentése a fenti. Kívánt esetben az (A) általános képletű vegyületeket savaddíciós sóikká alakítjuk. 15 A találmány értelmében tehát eljárhatunk úgy, hogy az R5 kromofór csoportot a peptid-lánc első aminosavjához kapcsoljuk, majd két további kapcsolási lépéssel kialakítjuk a kromofór csoportot hordozó, (A) általános képletű tripeptidet, vagy a kromofór csoportot 20 hordozó aminosavat egy előre elkészített dipeptiddel kapcsoljuk össze. Eljárhatunk továbbá úgy is, hogy az R5 kromofór csoportot a megfelelő dipeptidbe építjük be, majd az így kapott vegyülethez kapcsoljuk az (A) általános képletnek megfelelő tripeptid utolsó aminosav-25 részét. Az (A) általános képletű vegyületeket végül úgy is előállíthatjuk, hogy először önmagában ismert módon kialakítjuk a tripeptid-vázat, majd a kapott tripeptidhez kapcsoljuk az R5 kromofór csoportot. A peptid-származékok lépésről lépésre történő fel-30 építésében a peptid-kémiában általánosan ismert és alkalmazott kapcsolási módszereket használhatjuk. Az amino-csoportok védelmére a peptid-kémiában általánosan ismert és alkalmazott védőcsoportokat, például benziloxikarbonil-csoportot (Cbo), p-metoxiben-35 ziloxikarbonil-csoportot (MeOCbo), p-nitro-benziloxikarbonil-csoportot (N02 Cbo), p-metoxi-fenil-azo-benziloxikarbonil-bobenzoxi-csoportot (MCbo), terc-butoxikarbonil-csoporíot (BOC), trifluoracetil-csoportot (TFA) vagy formil-csoportot használhatunk. Az a-hely-40 zetű karboxil-csoport aktiválása során a megfelelő vegyületet a peptid-kémiában általánosan alkalmazott ismert aktivált származékaivá, például p-nitro-fenil-észterré, triklór-fenil-észterré, pentaklór-fenil-észterré, N-hidroxi-szukcinimid-észterré, savaziddá, szimmetrikus 45 anhidriddé vagy vegyes anhidriddé alakíthatjuk. Ezeket az aktivált származékokat elkülöníthetjük, vagy közvetlenül tovább reagáltathatjuk. Az oc-helyzetű karboxil-csoportot karbodiimiddel, például N,N-diciklohexil-karbodiimiddel is aktiválhatjuk. Az amino-peptid-50 vagy aminosav-származékok C-terminális karboxil-csoportját észterré, például metil-, etil- vagy izopropilészterré alakítva, vagy a kromofór anilin-csoport beépítésével védhetjük. A kromofór csoport ennek megfelelően a peptid-lánc felépítése során a védőcsoport szerepét 55 is betöltheti. A reakcióban részt nem vevő szabad funkciós csoportokat a peptidek vagy peptid-származékok szintézise során a következőképpen védhetjük: Az arginil-egység S-guanidino-csoportjának védelmére a peptid-kémiában általánosan alkalmazható 60 amino-védőcsoportokat, például —N02 csoportot vagy p-toluolszulfonil-csoportot (Tos) használhatunk, vagy a guanidino-csoportot protonfelvitellel védhetjük. Az lizil-egység e-amino-csoportjára védőcsoportként benziloxikarbonil-csoportot (Cbo), terc-butoxikarbonil-cso-65 portot (BOC) vagy 4-toluolszulfonil-csoportot (Tos) 2