170669. lajstromszámú szabadalom • Eljárás peptid-peptidohidroláz-típusú proteolitikus enzimek mennyiségének meghatározására, és eljárás a reagensek előállítására
19 170669 20 ban Sephadex LH—20 gélen szűrjük. 360 mg (96%) kristályos (XVIIIa) képletű vegyületet kapunk vékonyrétegkromatográfiásan (futtatószer: séges. Pi elegy) egy-b) lépés: N-Ac-lle-Ile-Arg-pNA.HCl (XVIII) Kiindulási anyagként 200 mg (0,40 mmól) (XVIIIa) képletű vegyületet használunk fel. A reakciót az 1. példában leírt módon hajtjuk végre. A kapott terméket 33%-os vizes ecetsavban Sephadex G—15 gélen szűrjük. 10 A szűrletet fagyasztva szárítjuk. 161 mg (90%) amorf (XVIII) képletű vegyületet kapunk, amely vékonyrétegkromatográfiásán (futtatószer: A elegy) egységes. A termék klórtartalma 5,50%; forgatóképessége: MD = -55,0° (c=0,9, 50%-os ecetsavban). Amino- 15 sav-elemzés eredménye: He: 2,0; Arg: 0,9. A példák szerint előállított reagenseket a következőképpen használjuk fel enzimek meghatározására: Az egyik meghatározási módszer — amelyet a későbbiekben részletesen ismertetünk — azon alapul, hogy 20 az (A) általános képletű reagensekből enzimes hidrolízis hatására képződő termék ultraibolya abszorpciós spektruma teljes mértékben eltér a kiindulási reagensétől. Az enzimes hidrolízis hatására lehasadó NH2 —R 6 általános képletű vegyületek — ahol R6 jelentése a fenti — 25 405 nm hullámhossznál jól mérhetők; ezen a hullámhosszon az alapreagensek abszorpciója jelentéktelen. Egy további eljárásmód szerint az enzimes hidrolízis hatására lehasadó NH2 —R 6 általános képletű vegyületekből — ahol R6 jelentése a fenti — diazotálással, majd 30 azt követő kapcsolási reakcióval (kapcsolódó reagensként például N-(ß-naftil)-etilendiamint használhatunk fel) azoszínezéket képezünk, és a képződött azoszínezék mennyiségét fotometriás úton mérjük. Eljárhatunk úgy is, hogy az enzimes hidrolízis hatá- 35 sara lehasadó NH2 —R 6 általános képletű vegyületek mennyiségét közvetlen fotometriás méréssel határozzuk meg. Ez a módszer az R6 helyén nitrofenil- vagy nitronaftil-csoportot tartalmazó vegyületek esetén alkalmazható. 40 Az R6 helyén naftil-csoportot tartalmazó (A) általános képletű peptidekből enzimes hidrolízis hatására lehasadó naftilamin mennyiségét fluoreszcencia-spektrofotometriás úton is mérhetjük. A következőkben az ultraibolya abszorpciós spekt- 45 rum felvételével végzett elemzési módszert részletesen ismertetjük. Példaként az N-Bz-Leu-Arg-pNA. HCl (a 2. példa szerint előállított reagens) felhasználásával végzett elemzést írjuk le; ugyanez az elemzési módszer azonban valamennyi egyéb reagens felhasználásával is 50 végrehajtható. A 2. példa szerint előállított reagens ultraibolya abszorpciós spektrumában X = 302 nm-nél jelenik meg maximum (s = 12 920), és 405 nm hullámhosszon a reagens abszorpciója jelentéktelen. A reagensből enzi- 55 mes hidrolízis hatására képződő p-nitro-anilin abszorpciós maximuma 380 nm-nél jelentkezik (moláris extinkciós koefficiens: 13 200), és a moláris extinkciós koefficiens 405 nm hullámhosszon csak 9620-ra csökken. 60 Ennek megfelelően az enzimes hidrolízis mértékét — amely arányos a képződött p-nitro-anilin mennyiségével — 405 nm hullámhosszon végzett spektrofotometriás méréssel igen könnyen követhetjük. A reagens fölöslege az adott hullámhosszon nem zavarja a meg- 65 határozást. Hasonló a helyzet a találmány szerint előállított egyéb reagenseknél is, ezért a spektrofotometriás méréseke't minden esetben 405 nm hullámhosszon végeztük. Az enzimes reakciót a következő egyenlettel írhatjuk le: E + S i^==í ES k2 ES' + kromofór Pj k4 E+P2 Az egyes betűjelzések jelentése a következő: E = enzim S = reagens ES = enzim-reagens komplex Pj és P2 = termékek kj, k2 , k 3 és k 4 = sebességi állandók Az ES komplex disszociáció-állandója: k2 — = Km (Michaelis-állandó) ki Ha (S)»(E) és k4 <sck 3 , a következő egyenlet érvényes: t(E)-(ES)] • (S) Km =— (1) (ES) A P, kromofór termék képződési sebessége: v=k3 .(ES), azaz k3 .(E)-(S) v= — Km +(S) Ha az összes E csoport S csoporthoz kapcsolódik (ES) = (E), következésképpen v=vmax=k 3 .(E) A Linewaver-Burk egyenletet bevezetve: l_Km 1 1 v vmax (S) v max (2) (3) (4) Amint a (2) egyenletből látható, a reagens egy adott enzimre vonatkoztatott hatékonyságát a Km és k 3 állandók szabják meg. E két állandót a következőképpen határozzuk meg: az enzimet és a reagenst puffer oldat -ban elegyítjük egymással, és 5 percen át spektrofotometriás úton követjük a reakciót. A reagens (S) koncentrációja változik, míg az enzim (E) koncentrációját minden egyes reagensnél állandó értéken tartjuk. Az extinkciót (OD) az idő függvényében ábrázoljuk (OD/t). Az így kapott görbéből meghatározzuk a nulla időponthoz tartozó tangens-értéket ( = percenkénti extitíkciókülönbség, AOD/perc, amelyből kiszámítható a percenként képződött pNA mennyisége (v, (imól)], amely a kezdeti reakciósebességet (v) adja. Az 1/v értéket 1/(S) függvényében ábrázoljuk, és a kapott diagramból meghatározzuk a (4) egyenletben szereplő Km és v max értékeket. A tripszinre és különböző reagensekre vonatkozó Km és k 3 [ = v max /(E)] értékeket az 1. táblázatban, a trombinra vonatkozó megfelelő értékeket a 2. táblázatban kö|Äük. Egyes enzim-reagens párok esetén a táblázat nem tartalmazza a Km és k 3 értékeket. Ez azt jelenti, hogy ezeket az értékeket nem határoztuk meg, vagy ezek az értékek nem számíthatók, mert 1/v és 1/(S) között nincs lineáris összefüggés. Az egyes enzim-reagens párok reakcióit közelítően úgy értékelhetjük, hogy összehasonlítjuk az azonos reagens-10
