170669. lajstromszámú szabadalom • Eljárás peptid-peptidohidroláz-típusú proteolitikus enzimek mennyiségének meghatározására, és eljárás a reagensek előállítására
21 170669 22 koncentráció esetén percenként és milliliterenként képződő p-nitro-anilin mennyiségét. Ezeket az értékeket a 3. táblázatban tripszinre, a 4. táblázatban trombinra és az 5. táblázatban plazminra adjuk meg. A NIH jelölés „National Institute of Health"-egységet, jelent. A „tripszin-egység" azt az enzim-mennyiséget jelenti, amelynek hatására 25 C°-on, 8,1 pH-értékenl 0,01 mól kalcium-ion jelenlétében 1 perc alatt 1 |i.mó N-tozil-arginin-metilészter-hidroklorid (TAME) hidrolizál el. A tripszint a Worthington Biochemical Corporation cégtől (Freehold, N. J., Amerikai Egyesült Államok) szereztük be, a plazmin saját gyártmány. 1 mg plazmin 3 casein-egységnek (CU) felel meg. 1. táblázat Tripszin-aktivitás Reagens (képlet) Reagens konc. nmól/ml Enzim konc. NIH/ml Képződött p-nitro-anilin [imól/percxml Reagens (képlet) Reagens konc. (imól/ml Enzim konc. NIH/ml Km xl0* mól/l k„xl04 (imól/perc, NIH/ml BAPNA 250—666 75 16 8,3 (I) 33,6—112,0 6 7,40 330 (II) 35,0—150,0 3,3 0,64 276 (IV) 35,0—150,0 3,3 0,17 71 2. táblázat TROMBIN-AKTIVITÁS Reagens (képlet) Reagens konc. umól/ml Enzim n xm [ k 3 xI0* konc. £Jo!/1 nmól/perc, NIH/ml ' NIH/ml BAPNA 250—666 50 ~6 ~11 (I) 33,6—112.0 10 2,92 40 3. táblázat TRIPSZIN-AKTIVITÁS Reagens (képlet) Reagens konc. |xmól/ml Enzim konc. egység/ml Képződött p-nitro-anilin nmól/percxml BAPNA 333,0 50,0 1,04 (II) 66,9 0,0833 14,2 (III) 66,7 0,0833 16,8 (IV) 67,0 0,0833 10,2 (V) 66,3 0,0833 22,7 (VI) 66,8 0,0833 12,8 (VII) 66,2 0,0833 16,6 (VIII) 66,7 0,0833 17,1 (IX) 67,0 0,0833 12,0 (X) 67,1 0,0833 15,5 (XI) 66,3 0,0833 12,4 (XII) 65,9 0,0833 16,5 (XIII) 66,9 0,0833 16,7 4. táblázat TROMBIN-AKTIVITÁS Reagens (képlet) Reagens konc. [imól/ml Enzim konc. NIH/ml Képződött p-nitro-anilin ttmól/percxml BAPNA 333,0 2,08 6,1 (II) 66,9 0,417 1,8 (III) 67,2 0,417 0,5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 (IV) 67,0 0,417 0,9 (V) 66,5 0,417 1,7 (VI) 66,8 0,417 0,2 (VII) 66,2 0,417 0,4 (VIII) 66,7 0,417 0,1 (IX) 67,0 0,417 0,3 (X) 67,1 0,417 0,4 (XI) 66,3 0,417 0,2 (XII) 66,3 0,417 0,7 (XIII) 66,9 0,417 0,2 (XVII) 67,0 4. táblázat 0,417 0,1 PLAZMIN-AKTIVITÁS Reagens (képlet) konc. nmól/ml Enzim konc. CV/ml Képződött p-nitro-anilin nmól/perc x ml (II) 66,9 0,167 2,7 (III) 66,7 0,167 17,2 (IV) 67,0 0,167 2,7 (V) 66,5 0,167 7,7 (VI) 66,8 0,167 2,8 (VII) 66,2 0,167 2,2 (VIII) 66,7 0,167 4,0 (IX) 67,0 0,167 1,5 (X) 67,1 0,167 17,2 (XI) 66,3 0,167 2,0 (XII) 65,9 0,167 1,5 (XIII) 66,9 0,167 17,9 (XVII) 67,0 0,167 21,3 A táblázatok adataiból világosan látható, hogy a találmány szerint előállított reagensek lényegesen előnyösebbek a tripszin vizsgálatára eddig felhasznált BAPNA megjelölésű amid-reagensnél. Az új reagensek fokozott érzékenységük következtében kismennyiségű enzim meghatározását is lehetővé teszik anélkül, hogy a meghatározás pontossága csökkenne. Klinikai szempontból ez igen fontos előny, minthogy így a meghatározáshoz kevesebb biológiai eredetű mintára van szükség. Szabadalmi igénypontok 1. Eljárás peptid-peptidohidroláz-típusú proteolitikus enzimek mennyiségének meghatározására, azzal jellemezve, hogy a vizsgálandó enzimet valamely (A) általános képletű, kromofór csoportot tartalmazó, tripeptidtípusú diagnosztikai reagenssel — ahol az aminosavak konfigurációja D, L vagy DL, Rj hidrogénatomot, 1—4 szénatomos alkanoil-csoportot vagy benzoil-csoportot jelent, R2 hidrogénatomot vagy ciklohexil-csoportot jelent, X jelentése metilén-csoport vagy vegyértékkötés, R3 3—5 szénatomos egyenes vagy elágazó láncú alkilcsoportot vagy 3—8 szénatomos gyűrűs alkil-csoportot jelent, R4 3—5 szénatomos egyenes vagy elágazó láncú alkilcsoportot vagy 3—8 szénatomos gyűrűs alkil-csoportot jelent, 11
