170669. lajstromszámú szabadalom • Eljárás peptid-peptidohidroláz-típusú proteolitikus enzimek mennyiségének meghatározására, és eljárás a reagensek előállítására
17 170669 18 c) lépés: Cbo-Leu-Leu.Arg(NC>2)-4-NOrl-NA (XVIc) Kiindulási anyagként 520 mg (0,81 mmol) (XVIb) képletű vegyületet és 375 mg (0,97 mmól) Cbo-Leu-OpNP-t használunk. A reakciót az 1. példa b) lépésében leírt módon végezzük. A nyers terméket metanolban, Sephadex LH—20 gélen szűrjük. 378 mg (62%) részben kristályos (XVIc) képletű vegyületet kapunk, amely vékonyrétegkromatográfiásan (futtatószer: Pt elegy) egységes, [a]" = —18,0° (c = 1,0, dimetüformamidban) d) lépés: N-Bz-LeU-Leu-Arg(N02 )-4-N0 2 -l-NA (XVId) Kiindulási anyagként 150 mg (0,2 mmól) XVIc képletű vegyületet és 57 mg (0,25 mmól) Bz2 0-t használunk. A reakciót a 2. példa a) lépésében leírt módon végezzük. A nyers terméket metanolban, Sephadex LH—20 gélen szűrjük. 120 mg (83%) amorf (XVId) képletű vegyületet kapunk, amely vékonyrétegkromatográfiásan (futtatószer: P, elegy) egységes, [a]" = —30,9° (c=0,95, dimetüformamidban). e) lépés: N-Bz-Leu-Leu-Arg-4-NOrl-NA. HCl (XVI) Kiindulási anyagként 120 mg (0,165 mmól) (XVId) képletű vegyületet használunk. A reakciót az 1. példában leírt módon végezzük. A nyers terméket 33%-os ecetsavban, Sephadex G—15 gélen szűrjük. Az eluátumot liofilizáljuk. 48 mg (42%) amorf, 4,95% klórtartalmú (XVI) képletű vegyületet kapunk, amely vékonyrétegkromatográfiásán (futtatószer: A elegy) egységes. [«]£= -36,00° (c=0,71, 50%-os ecetsavban). Aminosav-elemzés eredménye: Leu: 2,0; Arg: 0,9. 17. példa N-Bz-Leu-Leu-Lys-pNA. HCl (XVII) a) lépés: N-BOC-Lys(s-Cbo)-pNA (XVIIa) 6,3 g (11,2 mmol) N-BOC-Lys(e-Cbo)-ÖH. DCHA-t szobahőmérsékleten 40 ml vízmentes, frissen desztillált HMPTA-ban oldunk, és az oldathoz keverés közben, részletekben, vízmentes körülmények között 5 g (30,5 mmól) p-nitro-fenü-izocianátot adunk. A reakcióelegyet 24 órán át szobahőmérsékleten tartjuk, majd az 1. példa a) lépésében leírt módon feldolgozzuk. Az oldhatatlan N.N^bisz-p-nitro-fenil-karbamidot kiszűrjük, és a szűrletet metanollal egyensúlyba hozott Sephadex LH—20 oszlopon szűrjük. 4,17 g (74,5%) részben kristályos (XVIIa) képletű vegyületet kapunk, amely vékonyrétegkromatográfiásan (futtatószer: Pj elegy) egységes, [a]" = +1,7° (c = 1,0, dimetüformamidban). b) lépés: N-BOC-Leu-Lys(s-Cbo)-pNA (XVIIb) 2,20 g (4,4 mmól) (XVIIa) képletű vegyületet vízmentes körülmények között 10 ml frissen desztillált trifluorecetsavban oldunk. A reakcióelegyet 1 órán át szobahőmérsékleten keverjük, majd lassú ütemben, erélyes keverés közben 150 ml vízmentes éterbe öntjük. Hűtés hatására H-Lys(e-Cbo)-pNA.CF3 COOH válik ki. Az éteres fázist dekantálással elválasztjulíj^ az amorf csapadékot 3 X 75 ml éterrel mossuk, majd vákuumban, foszforpentoxid és nátriumhidroxid fölött szárítjuk. 2,25 g (100%) H-Lys(s-Cbo)-pNA.CF3COOH-t kapunk. 2,25 g (4,4 mmól) CF3 COOH. H-Lys(e-Cbo)-pNA-t 10 ml dimetüformamidban oldunk. Az oldatot —10 C°ra hűtjük, és a bázis felszabadítása céljából 0,78 ml (5,5 mmól) Et3 N-t adunk. Ezután az elegyhez 2,4 g (6,5 mmól) BOC-Leu-OpNP-t adunk, és az oldatot szobahőmérsékletre hagyjuk melegedni. Az elegyet 3 5 óra elteltével ismét —10 C°-ra hűtjük és 0,31 ml (2,2 mmól) Et3 N-nal pufferoljuk. Ezt a műveletet 2-3 óra elteltével megismételjük. Összesen 24 órás reakcióidő után az elegyet vákuumban 40 C°-on szárazra pároljuk. A maradékot 3 X20 ml desztillált vízzel mossuk, és 10 vákuumban szárítjuk. A kapott nyers terméket metanolban oldjuk, és az oldatot metanollal egyensúlyba hozott Sephadex LH—20 gélen szűrjük. 1,70 g (70%) amorf (XVIIb) képletű vegyületet kapunk, amely vékonyrétegkromatográfiásan (futtatószer: P^ illetve C elegy) 15 egységes. [OC]D = —4,9° (c = 1,1, dimetüformamidban). c) lépés: N-BOC-Leu-Leu-,Lys(s-Cbo)-pNA (XVIIc) Kiindulási anyagként 950 mg (1,55 mmól) (XVIIb) képletű vegyületet és 1,16 g (3,1 mmól) BOC-Leu-OpNP-t 20 használunk. A reakciót a 17. példa b) lépésében leírt módon végezzük. A nyers terméket metanolban, Sephadex LH—20 gélen szűrjük. 985 mg (88%) amorf (XVIIc) képletű vegyületet kapunk, amely vékonyrétegkromatográfiásan (futtatószer: Pj elegy) egységes. [a]j5° = 25 = - 22,0° (c = 1,0, dimetüformamidban). d) lépés: N-Bz-Leu-Leu-Lys(s-Cbo)-pNA (XVIId) Kiindulási anyagként 1,25 g (1,4 mmól) (XVIIc) képletű vegyületet és 384 mg (1,7 mmól) Bzz O-t használunk. 30 A (XVIIc) képletű vegyület butoxikarbonil-csoportját a 17. példa b) lépésében leírt módon lehasítjuk. Az így kapott száraz H-Leu-Leu-Lys(e-Cbo)-pNA.CFr COOH-t 20 ml dimetüformamidban oldjuk, az oldatot —10 C°-ra hűtjük, majd a bázis felszabadítása érdeké-35 ben 200 ml (1,45 mmól) Et3 N-t adunk az elegyhez. Az oldathoz -10 C°-on 384 mg (1,7 mmól) Bza O-t adunk, majd az elegyet a 17. példa b) lépésében leírt módon kezeljük. A nyers terméket metanolos oldatban, Sephadex LH—20 gélen szűrjük. 920 mg (90%) részben 40 kristályos (XVIId) képletű vegyületet kapunk, amely vékonyrétegkromatográfiásan (futtatószer: Pj, illetve C elegy) egységes, [aß 0 = -5,95° (c = l,02, dimetüformamidban). 45 e) lépés: N-Bz-Leu-Leu-Lys-pNA. HCl (XVII) Kiindulási anyagként 300 mg (0,41 mmól) (XVIId) képletű vegyületet használunk fel. A reakciót az 1. példában leírt módon végezzük. A nyers terméket 33%^os ecetsavban, Sephadex G—15 gélen szűrjük. 170 mg 50 (66%) liofilizált, amorf (XVII) képletű vegyületet kapunk, amely vékonyrétegkromatográfiásan (futtatószer: A elegy) egységes. Klórtartalom: 5,51%. [«]% = -50,5° (c =0,62, 50%-os ecetsavban). Aminosav-elemzés eredménye: Leu: 2,0; Lys: 0,35. 55 18. példa N-Ac-Ile-Ile-Arg-pNA. HCl (XVIII) 60 a) lépés: N-Ae-Ile-Ile-ArgíNO^-pNA (XVIIIa) Kiindulási anyagként 440 mg (0,63 mmól) (Xla) képletű vegyületet és 76 mg (0,76 mmól) ecetsavanhidridet használunk fel. A reakciót a 2. példa a) lépésében leírt 65 módon végezzük. A kapott terméket metanolos oldat 9
