170665. lajstromszámú szabadalom • Eljárás aminocukor származékok tiszta állapotban való elkülönítésére keverékeikből
15 170665 16 oldunk 100 ml, 7,0 pH-értékű, 0,565 m trisz-HCl pufferben, majd hozzáadunk 1 ml detergens-oldatot (2 g Triton X 100 + 8 g 95%-os p. a. etanil), 1 ml dianizidinoldatot (260 mg o-dianizidin • 2 HCl 20 ml vízben) és 0,5 ml 0,1 %-os vizes peroxidáz-oldatot (Boehringer Nr. 15 302)] hozzáadásával leállítjuk és további 30 percen át 35 °C-on inkubáljuk. Ezután hozzáadunk 1 ml 50%-os H2S0 4 -et és 545 nm-en leolvassuk megfelelő vakpróbával szemben. Kiértékelés céljából meghatározzuk a beadagolt szacharóz %-os gátlását és az 50%-os gátlásból glükózgörbe segítségével átszámítjuk SIE/g, illetve SIE/liter értékre. Maltáz-próba Egy maltáz-inhibitor-egység (MIE) az az inhibitor mennyiség, amely két maltázegységet 50%-ig gátol. Egy maltáz egység (ME) az az enzimmennyiség, amely 1 perc alatt az alábbiakban megadott kísérleti körülmények között 1 [xmól maltózt 2 [j,mól glükózra hasít. A m[i, képződött glükózt glükózoxidáz reakció segítségével kvantitatíve határozzuk meg olyan körülmények között, amikor a maltáz hatására már nem megy végbe további maltóz-hasítás. A kísérlet megvalósításakor 0,05 ml maltáz-oldatot (disznóbél mucosa-ból származó oldott maltáz B. Borgström és A. Dahlquist szerint: Acta Chem. Scand 12 (1958), 1997. oldal, 6,0 pH-értékű 0,1 m Na-maleinátpufferrel 0,060—0,070 ME/ml-re hígítva) összekeverünk 0—20 [Ág inhibitorral vagy 0—20 \ú vizsgálandó oldattal és 6,0 pH-értékű 0,1 m Na-maleinátpufferrel 0,1 mire feltöltjük. 10 percen át 35 °C-on tartjuk, majd összekeverjük 0,1 mólos Na-maleinátpufferrel készített (pH = = 6), 35 °C-ra előmelegített, 0,05 mólos maltóz-oldat 0,1 ml-ével. 20 percen át 35 °C-on inkubáljuk, majd a maltáz-reakciót 1 ml glükózoxidáz-reagens (lásd szacharáz próba) hozzáadásával leállítjuk és további 30 percen át 35 °C-on inkubáljuk az elegyet. Ezután hozzáadunk 1 ml 50%-os kénsavat és 545 nm-en leolvassuk megfelelő vakpróbával szemben. Kiértékelés céljából meghatározzuk a beadagolt maltáz %-os gátlását és az 50%-os gátlásból glükóz-görbe segítségével átszámítjuk MIE/g, illetve MIE/liter értékre. Az egyes homológok és diszkrét homológ-tartományok esetében mért in vitro enzimgátló próbák eredményeit az alábbi táblázatban foglaljuk össze, ahol a hexózegységek glükózegységeket jelentenek. ni+ n 2 (aminocukor-származékban levő hexózegységek száma) AIE/g SIE/g MIE/g ni+n2 = l nj +n2 =2 ni +n 2 = 3 nj + n2 = 4—6 ni + n2 = 5—7 300 000 30 000 5 000 300 000 68 000 15 000 1 400 000 21 000 5 000 17 500 000 8 500 — 30 000 000 2 500 — Amint a táblázatból látható, a homológ sorban a növekvő molekulasúllyal erősen nő a specifikus gátló aktivitás pankreász-a-amilázzal szemben; így az nt + n 2 = = 5—7 tartomány in vitro százszor erősebb enzimgátlást mutat, mint az ^+^ = 1 vagy nt+n 2 =2 hexózegységeket tartalmazó aminocukor-származék. Másrészt a szacháráz-gáflás az nj +n2 = 2 származék esetében a legerősebb, az nj+n2 = l származék már csak fele olyan erősen gátol és a magasabb származékok tovább csökkenő specifikus szacharáz-gátló aktivitást 5 mutatnak. In vivo vizsgálatban a szacharóz-terhelési próbában mért hatékonyság körülbelül párhuzamos az in vitro mérésben talált specifikus gátló aktivitással. Ezzel szemben a keményítő terhelési próba esetén in vivo az 1, 2 10 és 3 hexózegységet tartalmazó aminocukor-származékok az in vitro mért amilázgátlással összehasonlítva 10—40-szeresre nőtt hatékonyságot mutatnak (lásd 18. példa, 1., 3., 4. és 5. táblázat.) Ismert, hogy az állatok és emberek esetén szénhidrát-15 tartalmú élelmiszerek és élvezeti cikkek (például gabona-, burgonyakeményítő-, gyümölcs, gyümölcslé, csokoládé, sör) elfogyasztása után hiperglikémia lép fel a szénhidrátok glikozidhidrolázok (például nyál- és pankreászamilázok, maltázok, szacharózok) hatására fel-20 lépő gyors lebomlásának következtében, az alábbi egyenleteknek megfelelően: keményítő, amiláz maltóz maltáz glükóz, illetve ill. glikolén 25 szacharóz szacharáz glükóz + fruktóz Ez a hiperglikémia cukorbetegek esetén különösen erős és hosszantartó. Adipositas-ban szenvedők esetén a hiperglikémia gyakran különösen erős inzulinkiválasztásban nyilvánul meg, amely fokozott zsírbeépítéshez 30 és csökkentett zsírlebontáshoz vezet. Az ilyen hiperglikémia következtében az egészséges anyagcseréjű és adipositas-ban szenvedő személyek esetért az inzulinkiválasztás következtében gyakran hipoglikémia lép fel. Ismeretes, hogy mind a hipoglikémia, mind a gyomor-35 ban tartózkodó gyomorpép elősegíti a gyomornedvképződést, amely gastritist, ulcus ventriculit vagy duodenit vált ki vagy annak kedvez. Azt találtuk, hogy a találmány szerinti eljárással nyert és izolált glükozidhidroláz inhibitorok csökkentik 40 a hiperglikémiát, hiperinzulinémiát, hipoglikémiát patkányok és/vagy emberek búzakeményítővel vagy szacharózzal vagy maltózzal történő terhelése után és gyorsítják ezeknek a megnevezett szénhidrátoknak a gyomron történő áthaladását. 45 Ezen túlmenően gátolják a glükóz reszorpcióját a bélből. Csökkentik, illetve hátráltatják a szénhidrátoknak a zsírszövet lipidjeivé való átalakulását és az elfogyasztott zsírok zsírszövet-raktárokba való beépülését. Ismert továbbá, hogy a szájüregben a szénhidrátokat, 50 különösen a szacharózt mikroorganizmusok lebontják és így elősegítik a fogszuvasodást. A glükozidhidroláz inhibitorok így az alábbi indikációk esetén alkalmazhatók: adipositas, hiperlipémia (atherosklerosis), diabetes, pre-55 diabetes, gastritis, ulcus ventriculi, ulcus duodeni és caries. Adagolás: naponta egyszer vagy többször 30—300 000 AIE/kg vagy 1—10 000 SIE/kg étkezés előtt és/vagy folyamán és/vagy után perorálisan. 60 Kiszerelési formák: tabletta, drazsé, kapszula, oldat, szemcse, szuszpenzió, fogkrém és szénhidráttartalmú élelmiszerek és/vagy élvezeti cikkek adaléka. A glükozidhidrolázok találmány szerinti eljárással előállítható inhibitorainak és a glükózreszorpciót gátló 65 anyagoknak a toxicitása extrémen alacsony. A 9. példa 8
