170665. lajstromszámú szabadalom • Eljárás aminocukor származékok tiszta állapotban való elkülönítésére keverékeikből
13 170665 14 A (3-amilázzal végzett lebontási kísérletek eredményeit az alábbiakban foglalhatjuk össze: A kiindulási anyagban A bomlástermékekben található glükózegysé- található glükózegysé- Eltávolított maltóz- 5 gek száma gek száma egysegek száma 4 4 0 2 1 10 5 5 0 3 1 15 6 6 0 4 1 2 2 20 7 7 0 5 1 3 2 25 8 8 0 6 1 4 2 2 3 30 Látható, hogy bizonyos esetekben a kiindulási anyag egy része változatlan marad. E lebomlási kísérletekkel kapcsolatban ismételten hangsúlyozni szükséges, hogy a ß-amilaz csak maltózegységeket képes eltávolítani és ezeket is csak egy oli- 35 goszacharid nem-redukáló végéről. El kell tehát kerülni bármiféle korlátozó jellegű elmélet érvényesítését. Bár a találmány szerinti homológ sor ezen magasabb tagjainak pontos szerkezete nem teljesen tisztázott, a fenti kísérleti eredményekből az a következtetés vonható 40 le, hogy a 4, 5,6,7 és 8 glükózegységet tartalmazó I általános képletű vegyületek a IV képletű alacsonyabb homológ olyan származékai, amelyek egymással a, l->-4 kötésben kapcsolt glükózegységekből 2, 3, 4, 5 vagy 6 egységet tartalmazó láncot tartalmaznak, ahol az oli- 45 goszacharidlánc «-konfigurációban kapcsolódik a ciklohexéngyűrű 4-helyzetéhez. A tárgyalt magasabb homológok metil-jodid és nátrium-hidrid elegyével dimetil-szulfoxidban végzett metilezése, majd az ezt követő totálhidrolízis, gázkroma- 50 tográfiás elemzés végrehajthatóságához szükséges származékképzés és gázkromatográfiás elemzés útján a 2,3,6-trimetil-glükóz-származék mutatható ki, azaz a glükózegységek szükségszerűen lineáris szerkezetben, l-«-4 kötéssel kapcsolódnak egymáshoz. 55 Egy másik metilezési termék a 2,3,4,6-tetrametil-származék, amely a metilezett vegyület jellegétől függően eltérő mennyiségben vagy akár egyáltalán nem képződik. E származék előfordulása és mólviszonya a trimetilszármazékhoz a ciklohexéngyűrűhöz kötött szubszti- 60 tuens jellegétől függ. A találmány szerinti eljárással előállított I általános képletű vegyületek specifikus gátló aktivitását az alább ismertetett, in vitro enzimgátló próbákkal határozzuk meg. 65 Amiláz-próba Egy amiláz-inhibitör egység (1 AIE) az az inhibitor mennyiség, amely két amiláz-egységet 50%-ig gátol. Egy amiláz-egység (AE) az az enzimmennyiség, amely 1 perc alatt a megadott kísérleti körülmények között 1 |x egyenérték glükozid-kötést hasít fel keményítőben. A fxVal felhasított kötéseket mint [JiVal képződött redukálócukrot dinitroszalicilsavval határozzuk meg kolometriásan és maltóz kalibrációs görbe segítségével mint fxVal maltóz-egyenértékeket adjuk meg. A kísérlet megvalósításakor 0,1 ml amiláz-oldatot (20—22 AE/ml) összekeverünk 0—10 [xg ingibitorral vagy a vizsgálandó oldat 0—20 |i.l-ével 0,4 ml 0,02 m nátriumglicerofoszfátpuffer/0,001 m CaCl2 -ban pH — 6,9 értéken és körülbelül 10—20 percen keresztül vízfürdőn 35 °C-on egyensúlyban tartjuk. Ezután 5 percen keresztül 35 °C-on inkubáljuk 0,5 ml 35 °C-ra melegített 1%-os keményítőoldattal (oldható keményítő, gyártja Merck, Darmstadt, Nr. 1252) és ezt követően összekeverjük 1 ml dinitroszalicilsav-reagenssel (P. Bernfeld, Colowick-Kaplan, Meth. Enzymol. c. könyvében Band 1, 149). A szín kifejlesztése céljából az elegyet 5 percen keresztül forrásban levő vízfürdőn melegítjük, majd lehűtjük és 10 ml desztillált vízzel összekeverjük. Az extinkciót 540 mfx-on mérjük megfelelő amiláz nélküli vakpróbával szemben. Kiértékelés céljából egy előzőleg felvett amiláz kalibrációs görbéből leolvassuk az inhibitor hozzáadása után még hatásos amiláz aktivitást és ebből kiszámítjuk a beadagolt amiláz %-os gátlását. A %-os gátlást a [i.g inhibitor + AE + + hányados függvényeként visszük fel, az 50%-ös gátlás pontját leolvassuk a görbéből és átszámítjuk AIE/mg inhibitor értékre. A fenti hányadosban + jelentése: szárazanyagra számítva és ++ jelentése: amiláz egység ugyanannak a sorozatnak a nem gátolt részében. Szacharáz-próba Egy szacharáz-inhibitor-egység (SIE) az az inhibitor mennyiség, amely két szacharáz-egységet 50%-ig gátol. Egy szacharáz egység (SE) az az enzimmennyiség, amely 1 perc alatt a megadott kísérleti körülmények között 1 |i,mól szacharózt glükózra és fruktózra hasít. A [j,mól hasított szacharózt a képződött glükózoxidáz reakció segítségével kvantitatíve határozzuk meg olyan körülmények között, amikor a szacharáz hatására már nem megy végbe további szacharóz-hasítás. A kísérlet megvalósításakor 0,05 ml szacharáz-oldatot [sertésbél mucosa-ból származó oldott szacharáz B. Borgström, és A. Dahlquist szerint: Acta Chem. Scand. 12 (1958), 1997. oldal] (0,12 SE/ml) 0,1 ml 0,1 mólos nátriummaleinátpufferben pH = 6,0 értéken összekeverünk 0—20 [Jig inhibitorral vagy 0—20 \ú vizsgálandó oldattal és 0,1 ml-re feltöltjük 6,0 pH-értékű, 0,1 m nátrium-maleinátpufferrel. 10 percen keresztül 35 °C-os vízfürdőn tartjuk, ezután összekeverjük 35 °C-ra előmelegített 0,05 m, 6,0 pH-értékű, 0,1 m nátrium-maleinátpufferral készített szacharóz-oldat 0,1 ml-ével. 20 percen át inkubáljuk 35 °C-on, majd a szacharáz-reakciót 1 ml glükózoxidáz-reagens [amelyet úgy készítünk, hogy 2 mg glükózoxidázt (Boehringer Nr. 15 423) fel-7
