170534. lajstromszámú szabadalom • Eljárás 2- amino- 4-hidroxi- 7,8- dihidro-pteridin vegyületeket tartalmazó antimikróbás hatású szinergetikus szerek előállítására
13 170534 14 szerelve, készlet formájában tartalmazzák, és e készletekhez humán- vagy állatgyógyászati utasítás van mellékelve. i) Kombinációs gyógyászati készítmények kokcidiózis kezelésére, amelyek hatásfokozásra alkalmas mennyiségű DMHP-t és hatásos mennyiségű szulfakinoxalint és diaveridint tartalmaznak. A találmányt az oltalmi kör korlátozása nélkül az alábbi példákban részletesen ismertetjük. 1. példa A feltételezett pteridin-antagonistákat úgy vizsgálhatjuk, hogy meghatározzuk azoknak a dihidropteridinsav (DPtA) bioszintézisében érintett enzimek, nevezetesen a hidroximetil-dihidropteridin-pirofoszfokináz (HMPPS) és a dihidropteroát-szintetáz (a továbbiakban: szintetáz) működésére gyakorolt hatását. 1) HMPPS: 2-amino-4-hidroxi-6-hidroximetil-7,8 --dihidropteridin (HMPt) + ATP Mg2+ 2-amino-4-hidroxi-6-pirofoszfometil-7,8-di-hidro-pteridin (Pt) + AMP 2) Szintetáz: Pt + p-amino-benzoesav (pAB) Mg2+ dihidrop téri dinsav (DPtA) + piro foszfát a) A HMPPS-re gyakorolt hatás vizsgálata során követjük az ATP-7-P32 terminális foszfát-csoportjának beépülését a Pt-be, és ennek alapján meghatározzuk a vizsgált vegyület HMPPS-aktivitást gátló hatását. A vizsgált vegyületet különböző metabolitokat és enzimeket tartalmazó kémcsövekbe helyezzük. Az egyes közegek összetételét az 1. táblázatban ismertetjük. A táblázat jelölései a következők: I: 2-amino-4-hidroxi-6-hidroximetil-7,8--dihidro-pteridin (HMPt) 800 ß mól koncentrációban II: E. coli kivonatból elkülönített, és a szintetáztól Sephadex G-100 ioncserélő gyantán Richey és Brown módszerével [J. Biol. Chem. 244, 1582-1592 (1969)] elválasztott HMPPS-forrás III: 3 mmol ATP-7-P32 IV: 0,10 mól semlegesített ATP (nem jelzett) V: 0,02 mól MgCl 2 • 6H 2 0 VI: 0,1 mól MgCl2 • 6H 2 0 VII: HMPPS és szintetáz-forrás VIII: A vizsgált vegyület 0,93 x 10~ 3 mól koncentrációban IX: 0,4mólpAB-C 14. Amint az 1. táblázatból megállapítható, az 1-9. kémcsövek HMPPS-forrást, jelzett ATP-t és 0,02 mól MgCl2 • 6H 2 0-t tartalmaznak, a 2—9. kémcsövek e komponenseken kívül HMPt-t is tartalmaznak, míg a 4—9. kémcsövek a felsoroltakon kívül vizsgálandó vegyületet is tartalmaznak. 5 A 10-12. (kontroll) kémcsövek HMPPS- és szintetáz-forrást, nem jelzett ATP-t, 0,1 mól MgClv • 6H2 0-t és jelzett pAB-t tartalmaznak. Az 1-9. kémcsövek tartalmát desztillált vízzel 200 jul térfogatra egészítjük ki, majd 60 percig 10 37 C°-on inkubáljuk, és ezután jéggel hűtjük. Az oldathoz 20 ßl de xtróz-oldatot (koncentráció: 72,1 mg/ml) és 5 jttl hexokináz-oldatot (koncentráció: 2000 egység/ml) adunk, és az elegyet 15 percig szobahőmérsékleten állni hagyjuk. Az egyes 15 kémcsövekhez 10-10 mg „Darco G-60" csontszenet adunk, és a kémcsövek tartalmát 10 percen át időnként kevergetjük. A csontszenet „Millipore AP 250 2200" szűrőn kiszűrjük, és a szűrőlepényt 3 x 10 ml hideg vízzel mossuk. Ezután meghatá-20 rozzuk a csontszén és a szűrő radioaktivitását. Maximális értéknek a 2. és 3. kémcsőből elkülönített anyagok radioaktivitását tekintjük, ezek ugyanis nem tartalmaznak vizsgálandó vegyületet, azaz enzim-gátlás értéke 0%. Az egyes vizsgálati 25 anyagok által okozott százalékos gátlást ezután úgy számítjuk ki, hogy a megfelelő kémcsövekből elkülönített anyagok radioaktivitását a fent meghatározott maximumhoz viszonyítjuk. A 10-12. kémcsövek tartalmát a b) pontban 30 ismertetésre kerülő módon kromatográfiásan elemezzük, és kontrollként használjuk. A 10. és 11. kémcsövek tartalmának aktivitását 100%-nak tekintjük, ezek a kémcsövek ugyanis nem tartalmaznak vizsgálandó vegyületet, azaz a gátlási érték 35 0%. A b) pontban ismertetésre kerülő módon vizsgált anyagok aktivitás-adatait a 10. és 11. kémcsöveknél meghatározott adatokhoz viszonyítjuk, és így számítjuk ki a százalékos gátlási értéket. b) A vizsgálandó vegyület szintetázzal szemben 40 kifejtett gátló hatását a dihidropteroát-C14 képződésének mérésével határozzuk meg. 50/ul semlegesített ATP-oldatból 50/ul 0,1 mól MgCl2 • 6H 2 0 oldatból, 100^1 0,1 mól ditiotreit-oldatból, 100 ^1 0,4 mól trisz-pufferoldatból 45 (pH-8,3), 25 Ml 876/i mól HMPt-oldatból és 170 jul HMPPS-t tartalmazó oldatból Pt-közeget készítünk. Az elegyet 60 percig 37 C°-on inkubáljuk, rövid ideig jéggel hűtjük, majd az oldathoz szobahőmérsékleten 100 ml dextróz-oldatot (koncent-50 ráció: 72,1 ml/mg) és 20/ul hexokináz-oldatot (koncentráció: 2000 egység/ml) adunk. Az elegyet 15 percig szobahőmérsékleten állni hagyjuk. Öt kémcsőbe egyenként 10 ßl 0,1 mól MgCl2 • •6H2 0 oldatot, 10/ul 0,4 mól pAB-C 14 oldatot, 55 20 í/1 0,1 mól ditiotreit-oldatot 20jul 0,4 mól trisz-pufferoldatot (pH 8,3) töltünk, majd az oldatokhoz 80-80 Ad fent készített Pt-oldatot, és a 2. táblázatban megadott mennyiségű szintetázt és/vagy vizsgálati vegyületet adunk. Az így kapott elegy 60 térfogatát desztillált vízzel 200/il-re egészítjük ki. Két kontroli-kísérletet végzünk. A kémcsövekbe ebben az esetben 10 ßl 0,1 mól ATP-oldatot, 10 jul 0,1 mól MgCl2 J-6H 2 0 oldatot, 20jul 0,1 mól ditiotreit-oldatot, 20jul 0,4 mól trisz-pufferoldatot 65 (pH 8,3), 10//I 0,4 mól pAB-C14 oldatot és 20^1 7
