170534. lajstromszámú szabadalom • Eljárás 2- amino- 4-hidroxi- 7,8- dihidro-pteridin vegyületeket tartalmazó antimikróbás hatású szinergetikus szerek előállítására
15 170534 16 ismert aktivitású, HMPPS-t és szintet ázt tartalmazó oldatot töltünk. A vizsgálandó vegyületet e két kémcső közül a másodikhoz adjuk 10—5 mól végső koncentrációnak megfelelő mennyiségben, majd mindkét kémcső tartalmának térfogatát desztillált vízzel 200 jul-re egészítjük ki. A hét kémcsövet ezután 30 percig 37C°-on inkubáljuk, jéggel hűtjük, majd a kémcsövek tartalmát kromatográfiás elemzésnek vetjük alá. Hasonlóan elemezzük az a) pontban ismertetett 10-12. kontroli-kémcsövek tartalmát is. Az elemzést a következőképpen végezzük: Az egyes kémcsövekből 100-100 pl oldatot különítjük el, és az oldatot 2 x 20 cm méretű Whatman No 3MM kromatorgáfiás papír alapvonalára cseppentjük. Sörensen-pufferoldattal vagy kálium-és nátrium-foszfát-pufferoldattal (0,1 mól, pH 7,0) 10-15 cm távolságig leszálló futtatást végzünk. A kromatogrammokon kialakult foltok viszonylagos helyzetéből meghatározzuk a szintetáz %-os gátlását a 10. és 11. sz. kontroli-kémcsövekhez viszonyítva, amelyekben a gátlás értéke 0%. A DMHP vizsgálati vegyület esetén kapott százalékos gátlási értékeket az 1. táblázat X. oszlopában, és a 2. táblázat 4. oszlopában tüntetjük fel. Értékes hatásfokozó szereknek tekintjük azokat a vegyületeket, amelyek e kísérletekben lOO/Ltmól-os vagy annál kisebb koncentrációban fejtenek ki 50%-os gátlást. Amennyiben e vegyületek toxicitása kedvező, azok felhasználhatók a találmány szerinti kompozíciók előállításához. A legelőnyösebb hatásfokozószerek IC5 0 -értékeit a 3. táblázatban közöljük. 2. példa Az (I) általános képletű vegyületek önmagukban, illetve kompetitorral és/vagy inhibitorral együtt kifejtett kokcidiosztatikus hatását szűrővizsgálatokkal mérjük, és az eredmények alapján meghatározzuk az egyes komponensek legcélszerűbb koncentrációarányait a kokcidiózís megszüntetése vagy visszaszorítása szempontjából. A vizsgálatokhoz Ranger-csirkéket használunk fel. Az állatokat kis, fűthető, drótalju ketrecekben tartjuk, és a ketreceket a környezetszabályozást lehetővé tevő izolációs kamrába helyezzük. Az állatokat spórás Eimeria-oocisztákkal, például Eimeria tenella vagy Eimeria acervulina oocisztákkal orálisan megfertőzzük. A vizsgálandó vegyületet, illetve keveréket (DMHP-t szulfakinoxalint (SQX) vagy diaveridint(DV), illetve ezek bármilyen kombinációját) laboratóriumi célokra szolgáló, speciális, K-vitaminban szegény táplálékkal („L.D.4" keverék) 1 : 10 arányban elegyítjük, és az így kapott előkeveréket vízszintes forgó dobban hozzákeverjük az állatok táplálékához. A vizsgált csirkéket a megfertőzést megelőző naptól kezdve a megfertőzést követő néhány (például 8 vagy 9) napig ezzel a táplálékkal etetjük. Néhány állatot kontroli-vizsgálathoz használunk fel, ezek hatóanyagmentes táplálékot kapnak. Az életben maradt állatokat a kísérlet utolsó napján leöljük. Mind a leölt, mind a kísérlet során elpusztult állatokat felboncoljuk, és meghatározzuk a vakbélfal károsodásának fokát. A kapott értékeket összehasonlítjuk a kontroli-csoportnál észlelt értékekkel, ez az összehasonlítás képezi a terápiás 5 aktivitás meghatározásának alapját. Ezen kívül az egyes csoportokban a pusztulási arányt és a százalékos súlygyarapodást is meghatározzuk. Az aktivitás jelentős vagy határozott lehet olyan esetekben is, amikor a pusztulási százalék a konroll-csoporttal 10 észlelttel azonos vagy ahhoz hasonló, ugyanis a hatásosságra a súlygyarapodás növekedése és a károsodások csökkenése jellemző. 1. kísérlet: 15 Egyhetes csirkékből álló ötös állatcsoportok tagjait orálisan egyenként 200 000 spórás E. tenella oocisztával (Weybridge törzs) fertőzünk meg. A megfertőzés előtt egy nappal az állatoknak a táp-20 lálékra számítva 10, 30, 90, illetve 250 milliomodrész mennyiségű DMHP-t adunk önmagában, vagy 30 milliomodrész diaveridinnel és 30 milliomodrész szulfakinoxalinnal együtt. Ezt a táplálékot a megfertőzést követő 8 napon át adjuk az állatoknak. 25 A megfertőzést követő 6. napon meghatározzuk az állatok kokcidiózis és vakbélkárosodás következtében beálló pusztulásának mértékét, és a megfertőzés napjától a 6. napig eltelt időközben mérjük az állatok súlygyarapodását. Ezeket az értékeket a 30 kezeletlen kontrollok megfelelő adataival hasonlítjuk össze. 2. kísérlet: 35 Egyhetes csirkékből álló tízes állatcsoportok tagjait egyenként 200 000 spórás E. tenella oocisztával (Weybridge-törzs) fertőzünk meg, majd az állatoknak az 1. kísérletnél leírt módon 60-60, 30-30, 40 15-15, illetve 7,5-7,5 milliomodrész mennyiségű diaveridin-szulfakinoxalin elegyet adunk önmagában, illetve 100 milliomodrész mennyiségű DMHP-vel kombinálva. Ebben a kísérletben a DMHP hatásfokozó képességét mérjük. 45 3. kísérlet: Egyhetes csirkékből álló tízes állatcsoportok minden tagját 100 000 spórás E. tenella oocisztával 50 fertőzzük meg, majd az állatokat az optimálisnál kisebb mennyiségű (15-15 milliomodrész) diaveridin-szulfakinoxalin elegyet tartalmazó táplálékkal, illetve az említett diaveridin-szulfakinoxalin elegyen kívül még 3, 10, 30 és 90 milliomodrész DMHP-t 55 tartalmazó táplálékkal etetjük. 4. kísérlet: Egyhetes csirkékből álló tízes állatcsoportok 60 minden tagját 100 000 spórás E. tenella oocisztával fertőzzük meg. Az állatoknak külön-külön, illetve különböző kettes vagy hármas kombinációkban 10 vagy 20 milliomodrész diaveridint, 20 vagy 40 milliomodrész szulfakinoxalint és 10 vagy 20 millio-65 modrész DMHP-t tartalmazó táplálékot adunk. Eb-8
