170416. lajstromszámú szabadalom • Új eljárás garamin előállítására
5 170416 6 tív micéliumának 1 ml-ével (élő csíraszám: 106 -10 7 /ml) steril körülmények között 2000 ml-es Erlenmeyer-lombikban levő 100 ml steril táptalajt oldunk be, melynek összetétele a következő: 1. oxoid húskivonat 0,3 g pepton 0,1 g szacharóz 0,1 g oldható keményítő 2,4 g kalciumkarbonát 0,4 g csapvíz 100 ml-re. Az elegy pH-ját a sterilezés előtt 7,0-ra állítjuk. A tenyészetet síkrázógépen (320 fordulat/perc, 3,7 cm kilengés) 37 C°-on 2 napig inkubáljuk. Az így kapott tenyészettel steril körülmények között 100 liter steril táptalajt oltunk be, melynek összetétele a következő: II. burgonyakeményítő 10 g szójaliszt 10 g szacharóz 4 g kalciumkarbonát 4 g pálmaolaj 2 ml. A táptalaj pH-ját a sterilezés előtt 7,0-ra állítjuk. A tenyésztést keverés és levegőztetés közben 40—50 órán át folytatjuk. A tenyésztés hőfoka 35 C°. a keverés 250 fordulat/perc, a levegőztetés 1/1 v/v. A beérett inokulumot használjuk fel az 1 m3 termelő fermentáció táptalajának oltásához. A termelő fermentáció táptalajának összetétele a következő: III. szójaliszt 30 g burgonyakeményítő 15 g kalciumkarbonát 5 g kobaltklorid (CoCl2 • 6H 2 0 1 mg pálmaolaj 2g csap víz 1000 ml-re. A táptalaj pH-ját sterilezés előtt 7,0-ra állítjuk. A sterilezést keverés közben 121C°-on, 1,3—1,4 atm nyomáson végezzük 1 órán keresztül. A tenyésztést saválló acél fermentorban végezzük. A keverő fordulatszáma 200—250/perc, a levegőztetés 1/1 v/v. A tenyésztés hőfoka 33 C°. A garamin-termelés a fermentáció 20—25. órájában indul meg, és a maximális értéket a 65—70. órában éri el. 2. lépés: a garamin elkülönítése Az 1. lépés szerint előállított 1000 liter erjesztéses oldat pH-ját szilárd oxálsav adagolásával (12 kg) 2,2-re állítjuk be, majd 1 órás keverés után az elegyet megszűrjük. A kapott 880 liter szűrlet pH-ját 25%-os ammóniumhidroxid-oldattal 7,0-ra állítjuk, és az elegyet újra megszűrjük. A kapott éles oldatot ezután 6 liter ammónium-formájú Wofatit CP-300 gyantát tartalmazó oszlopon (gyantaoszlop átmérő: 8 cm, rétegmagasság: 120 cm) folyatjuk át 60 liter/óra sebességgel. A gyantaágyat ezután 20 liter desztillált vízzel, majd 50 liter 0,08 n ammóniumhidroxid-oldattal mossuk át 5 liter/óra sebességgel. Ezután a garamint 50 liter 0,12 n ammóniumhidroxid-oldattal oldjuk le szintén 5 liter/óra sebességgel. 1000 ml-es eluvium frakciókat szedve a garamint tartalmazó 14-28 .frakciókat (ellenőrzés 5 rétegkromatográfiás módszerrel) egyesítjük,» és vákuumban 80 C°-on szárazra pároljuk. 51 g terméket kapunk, melynek garamin-tartalma kb. 40%. Ezt az anyagot feloldjuk 200inl desztillált vízben, és az oldat pH-ját 10%-os ammóniumhidroxid-oldattal 10 7,0-ra állítjuk be, majd 8g aktívszén hozzáadása és 30 perces keverés után az elegyet megszűrjük. A szűrletet 1200 ml ammónium-formában levő Amberlite CG-50-11 gyantát tartalmazó kromatografáló oszlopra (gyantaoszlop átmérő: 4,5 cm, réteg-15 magasság: 75 cm) visszük, é% a garamin leoldását 0,12 n vizes ammóniumhidroxid-oldattal végezzük 2 liter/óra sebességgel- 500 ml-es eluátum-frakciókat véve a tisztán garamint tartalmazó 12—16 frakciókat egyesítjük és vákuumban szárazra pároljuk. Ily 20 módon 21,8 g mintegy 90% tisztaságú garamint kapunk. Ebből az anyagból 15 grammot feloldunk 35 ml ionmentes vízben, és ezt az oldatot 1000 ml Dowex 1x2 (OH) 200-400»mesh gyantát tartalmazó oszlopra visszük (0 = 5 cm, h = 62cm). A 25 leoldási ionmentes vízzel,. 50 ml/óra sebességgel végezve, 100 ml-es frakciókat szedünk. A tisztán garamint tartalmazó 9-12-es frakciókat egyesítjük és vákuumban szárazra pároljuk. Ily módon 8,6 g gara'mint kapunk. 2. példa Garamin előállítása nyers gentamicin C 35 szulfátból A 168 778 számú magyar szabadalmi leírás példájának 1. és 2. lépése szerint előállított nyers antibiotikum szulfátsó elegyből 500 grammot fel-40 oldunk 2 liter desztillált vízben. Az oldat pH-ját koncentrált ammóniumhidroxid-oldattal 7,8-ra állítjuk be, majd 25 g aktívszén hozzáadása és 30 perc keverés után az elegyet szűrjük. A szűrletet 1 db 10 liter Amberlite CG-50 II (NH4) gyantát tartal-45 mázó kromatografáló oszlopra visszük (gyantaoszlop átmérő: 12 cm, gyantarétegmagasság: 88 cm) és 30 liter desztillált vízzel mossuk. A gyantaágyat ezután 100 liter 0,08 n ammóniumhidroxid-oldattal mossuk át 5 liter/óra sebességgel, majd a garamint 50 ugyancsak 100 liter 0,12 n ammóniumhidroxid-oldattal oldjuk le hasonló sebességgel. A 0,12 n ammóniás leoldásnál 10 literes eluátum frakciókat szedünk, és a rétegkromatográfiás vizsgálat alapján garamint tartalmazó .4—7-és frakciókat egyesítjük és ^5 vákuumban szárazra pároljuk. Ily módon 10,5 g 68% garamint tartalmazó terméket kapunk. Ebből az anyagból 15 grammot feloldunk 35 ml ionmentes vízben, és ezt az oldatot ;1000 ml Dowex 1 x 2 (OH) 200-400 mesh finomságú gyantát tartalmazó i0 oszlopra visszük (0 = 5 cm, h = 62 cm). A leoldást ionmentes vízzel, 50 ml/óra, sebességgel végezve. 100 ml-es frakciók esetén a tisztán garamint tartalmazó 9—12-es frakciókat( egyesítjük és vákuumban szárazra pároljuk. Ily módon 4,6 g garamint ^ kapunk.
