170416. lajstromszámú szabadalom • Új eljárás garamin előállítására
3 170416 4 00122 sz. alatt letétbe helyeztük az Országos Közegészségügyi Intézetnél a Mikroorganizmusok Nemzeti Gyűjteményében. A Micromonospora purpurea var. nigrescens törzs tenyésztésére a sugárgombák tenyésztésénél átalános szokásos módszereket alkalmaztuk. A tenyésztési körülményeket úgy választjuk meg — összhangban a garamin feltételezett prekurzor szerepével -, hogy a rövidebb, 60—80 órán fermentációs idő, valamint a magasabb tenyésztési hőmérséklet kedvezzen a garamin termelésének. A garamint célzó fermentációk táptalaj-igénye csökkent, ezért a főfermentáció során nem szükséges olyan költséges táptalaj-komponens alkalmazása, mint pl. a glicerin. Az inokulum táptalajból mellőzhető a kukoricalekvár, pepton, élesztőkivonat és kazeinhidrolizátum. Megállapítottuk továbbá azt is, hogy a garamin termelésére előnyös, ha intenzívebb levegőztetést, vagyis intenzívebb keverést biztosítunk. A fentiek alapján a találmány értelmében úgy állítunk elő garamint (0-3-dezoxi-4-C-metil-3-(N-metilam inoj-(3-L-arabino-piranozil(l-»6) -2-dezoxi-D-sztreptamin), hogy a garamin-tartalmú fermentléből vagy garamin-tartalmú nyers antibiotikum vizes oldatából a garamint pH = 5,0 és 10,0 között, célszerűen pH = 6,5 — 7,5 értéken valamely ammónium-formában levő karboxiltípusú kationcserélő gyantán megkötjük és a gyantaágyat híg, maximum 0,08 n ammóniumhidroxid-oldattal átmossuk, ezután a megkötött garamint 0,09-0,15 n, célszerűen 0,12 n ammóniumhidroxid-oldattal leoldjuk, és a garamint tartalmazó eluátum-frakciókból a vizet vákuumban történő bepárlással eltávolítjuk, adott esetben a garamint finomszemcsés karboxiltípusú kationcserélő gyantán, híg vizes, 0,08 — 0,50 n, célszerűen 0,12 n ammóniumhidroxid oldattal újból kromatografáljuk, majd az így kapott anyagot valamely, erősen bázisos, alkilamino-csoportokat tartalmazó hidroxilformában levő finomszemcséjű anioncserélő gyantán megkötjük, a gyantáról ionmentes vízzel szelektíven leoldjuk majd a garamint tartalmazó frakciókból a vizet vákuumban elpárologtatjuk. A találmány értelmében célszerűen úgy járunk el, hogy az erjesztéses oldatot pH = 2—3 értékre savanyítjuk, majd megszűrjük. A szűrlet pH-ját ammóniumhidroxiddal 7,0-ra közömbösítjük, majd a szűrletben levő összes bázisos anyagot valamely ammóniumformájú, karboxil típusú kationcserélő gyantán, célszerűen Wofatit CP-300 típusún megkötjük, a gyantaágyat ezután 0,08 n ammóniumhidroxiddal átmossuk, majd a garamint 0,12 n ammóniumhidroxiddal oldjuk le. Az ioncserélő gyanta 0,3 n ammóniumhidroxiddal végzett további leoldásával gentamicin C-t állíthatunk elő. A garamint tartalmazó frakciókat rétegkromatográfiás ellenőrzés után egyesítjük, majd szárazra pároljuk. Ily módon mintegy 40-45% tisztaságú garaminhoz jutunk. Az így kapott nyers garamint ezután finomszemcsés ammóniumformájú karboxil-típusú kationcserélő gyantán, célszerűen Amberlite CG-50 típusún kromatografáljuk híg vizes ammóniumhidroxid-oldat, célszerűen 0,12 n töménységű ammóniumhidroxid-oldat segítségével. A kapott mintegy 90% tisztaságú garamin bázist ezután erősen bázisos alkilamino-csoportokat tartalmazó finomszemcsés anioncserélő gyantaoszlopon kromatografáljuk ionmentes vízzel történő leoldással. Ily módon gyakorlatilag tiszta garamint kapunk. Eljárhatunk úgy is, hogy a 5 nyers garamint karboximetil-csoportot tartalmazó ioncserélő dextrángélen (CM-Sephadex C-25) kroma tograf áljuk ammónium-ciklusban híg (0,10-0,12 n) ammóniumhidroxid oldatokkal végzett szelektív leoldással. 10 A garamin előállítás kiindulási anyagként felhasználhatjuk a 168 778 lajstromszámú magyar szabadalmi leírás példájának 2. lépése szerint előállított nyers gentamicin-szulfátsót, vagy a 3. lépésben kapott 41-48 frakciókból származó anyagot is. 15 Ezen utóbbi eljárás különösen azért előnyös, mert a gentamicin taszítása során nyert olcsó melléktermékből kiindulva oldja meg a garamin előállítását. A találmány szerinti eljárással előállított garamin 20 színtelen, enyhén higroszkópos amorf por. Vízben igen jól oldódik, metanolban gyengébben, egyéb szerves oldószerekben gyakorlatilag oldhatatlan. Optikai forgatóképessége: (a)rj5 =+136° (1%, víz). Elemi analízise: C13 H 2 7N 3 0 6 (M = 321) összeg-25 képlet alapján: C =48,87%, H = 8,82%, N = 12,90%, O =29,41%. 30 Mágneses magrezonancia színképe az 1. ábrán látható. Az NMR színképet Varian A-60D típusú spektrométerrel vettük fel, kb. 0,4 ml deutériumoxiddal (D20) készült 20 mg/ml koncentrációjú oldattal, 3-(trimetilszilo)-propánszulfonsav nátrium-35 sójára mint belső standardra vonatkoztatva. Papírkromatográfiás Rf értéke 0.40, propanol : piridin : jégecet : víz 15:10:3:12 rendszerben. Kieselgel G rétegen kloroform : metanol: : 25%-os ammóniumhidroxid 1:2:2 rendszer alsó 40 fázisában futtatva 0,30-as Rf értéket ad ninhidrin reagenssel előhívva. A találmány szerinti eljárás legfőbb előnye, hogy nem igényli a sziszomicin előzetes mikrobiológiai előállítását, elkülönítését, majd igen ké-45 nyes lépésekből álló és a közbülső termékek kromatográfiás tisztítását igénylő kémiai lebontását, hanem egy ipari fermentációs terméknek, a gentamicin C-nek a gyártása során keletkező melléktermékből (a nyers gentamicin-szulfát kromatográfiás 50 tisztításánál nyert előfrakciókból) oldja meg a garamin előállítását, illetve a garamin előállítása mellett módot nyújt a gentamicin C előállítására is. Módszerünk igen gazdaságos, mert a melléktermékként nyert előfrakciókból egyetlen további tisztítási lé-55 pés közbeiktatásával teszi lehetővé a garamin előállítását. A találmány szerinti eljárás foganatosítására az alábbi kiviteli példákat adjuk meg. 60 1. példa 1. lépés: fermentáció A Micromonospora purpurea var. nigrescens 65 X-148 (MNG-122) törzs mélyhűtve tárolt vegeta-2
