170378. lajstromszámú szabadalom • Eljárás 1-[l-(-)-gamma-amino-alfa-hidroxibutiril]-kanamicin a előállítására
170378 13 14 juk, majd az oszlopot 300 ml vízzel átmossuk és 1 n ammónium-hidroxiddal eluáljuk. Az eluátumot 15 ml-es frakciókban összegyűjtjük. A 10-16. ninhidrid pozitív frakciókat egyesítjük és csökkentett nyomáson bepároljuk, ily módon egy szirupot kapunk, amely fokozatosan kikristályosodik. A kristályokat etanollal trituráljuk, megszűrjük és vákuum exszikkátorban szárítjuk, ekkor 0,78 g (66%) L-í-Vy-amino-aoxivajsavat kapunk. Olvadáspontja 206-207 C°. [a]g = -29° (c= 2,5, H2 0). Az IR-spektrumot ambutirozinból kapott hiteles mintával azonosítjuk. 7. példa 6'-Karbobenzoxi-l ,3,3"-tri-p-nitrobenzolkanamicin A készítése 9,0 g 6'-Karbobenzoxikanamicin A-t (14,5 mmól) szuszpendálunk 500 ml abszolút etanolban, 24 C°-on, majd 8,7945 g (58,2 mmól) p-nitrobenzaldehidet adunk hozzá. A keveréket 3 óráig forraljuk visszafolyatós hűtő alkalmazásával. Ez idő alatt a keverék tiszta, sárga oldattá változik, de kiválik egy fehér szilárd anyag is belőle. A melegítés után lehűtjük, a terméket szűrés után összegyűjtjük, majd kevés abszolút etanollal mossuk, 14,0 g (94,5%) fehér, kristályos szilárd terméket kapunk, melynek olvadáspontja 233-2340°. Analízis a C47 H S i N 7 0i 9 képletre: Számított: C 55,46, H5.05, N9,63; Talált: C 55,39, H5,08, N9,60. 8. példa l-[L-(—)-7-Amino-a-hidroxibutiril]-kanamicin A készítése 5,0 g (4,91 mmól) 6'-Karbobenzoxi-l,3,3"-tri-pnitrobenzalkanamicin A-t 50 ml dimetilformamidban (DMF) oldunk 24 C°-on. 2,064 g L{-)-7-benziloxikarbonil-amino-a-oxivajsav-N-hidroxiszukcinimidésztert (5,895 mmól) oldunk 20 ml dimetilformamidban folytonos keverés mellett és lassan, 75 perc alatt a Schiff bázis (III) oldatához adjuk. Az oldatot 24 C°-on egy éjszakán át kevertetjük. Gőzsugárszivattyús vákuumot használva, az oldatból az oldószert körülbelül 40 C°-on hirtelen elgőzölögtet-5 jük. Ezt a műveletet megismételjük 100 ml metanollal, ekkor viszkózus olajat kapunk. Az olajat 100 ml, 1:1 arányú dioxán-víz elegyben oldjuk és 10 ml jégecetet adunk hozzá. Az oldatot egy 500 ml-es Parr-palackba helyezzük 2,5 g 5%-os Pd/C-katalizátor-10 ral (Engelhard) együtt, és 3 atmoszféra, hidrogénnyomáson 24 C°-on, négy óra hosszat redukáljuk. Ez idő alatt a zárt edényben a teljes nyomásesés 6 atm, beleértve periodikus nyomásemelkedéseket. Az elegyet diatómaföld rétegen szűrjük át, amelyet 3X50 15 ml 50%-os dioxánnal mosunk. Az egyesített szűrleteket szárazra pároljuk, 100 ml n-butanollal azeotropizáljuk, végül metanollal újra bepároljuk, amikor viszkózus olajat kapunk. Ezt 30 ml metanolban feloldjuk és lassan, folytonos keverés mellett 1000 ml 20 hideg (5-10 C°-os) dietil-éterbe öntjük. Keverés után a kapott szuszpenziót 1/2 óra jégfürdőbe tesszük, a kivált csapadékot szűréssel összegyűjtjük, majd vákuum-exszikkátorban foszfor-pentoxid felett szárítjuk. 4,9620 g termékkeveréket kapunk. Vékonyréteg-25 kromatográfiás vizsgálat azt mutatja, hogy a termék főleg a IV képlétű vegyületből és kanamicin A-ból áll, igen kis mennyiségű di-és triszubsztituált kanamicin A, valamint 4-amino-2-oxivajsav jelenléte mellett. A különféle frakciókat elválasztjuk, ehhez egy 40 X 100 30 mm-es üvegoszlopot használunk, amelyet Amberlite IRC^40 gyantával (NH4 ciklus, I típus, 100/200 szemnagyság) töltünk meg úgy, hogy 980 mm-es gyantaágyat kapjunk. A nyers termékkeveréket feloldjuk 15 ml vízben és ezzel feltöltjük az oszlopot. 35 Az oszlopot víz és 2 n nátrium-hidroxid közötti gradiens oldatsorozattal eluáljuk, az eluátumot 15 ml-es frakciókban gyűjtjük össze. 295 frakciót gyűjtünk össze, majd az oszlopot 1,5 ml 3 n ammóniumhidroxiddal átmossuk. A frakciókat az optikai forga-40 tások alapján összegyűjtjük, és liofilizálással nyerjük ki belőlük a szilárd anyagokat. Frakció száma összetétel Súlyg Az egész nyers termék súlykorrekciója g bioelemzés hozam % 120-150. 201-224. 228-241. kana A BB-K-29 BB-K8 1,1654 0,40 0,6523 1,257 0,43 0,7036 809 42,6 786±101* 19,2** * 4 lemez elemzésének átlaga, ± standard eltérés ** A kinyert kana A-ra vonatkoztatva, a BB-K8 vegyületté (IV) való átalakulás 33,5%-os. Ebben a vizsgálatban a BB-K8/Kana A arány 0,45. A kapott IV vegyületet eredeti, antenticus termékkel azonosítjuk, amelyet az 5. példában hivatkozott szabadalmi leírás szerint kapunk. Olvadáspontja 194 C°.[a]g=+85°(c = 2,H20) A relatív aktivitás B. subtilissel szemben 960 mcg/mg. (agar táptalaj) (standard: kanamicin A szabad bázis): Analízis a C22 H43 N s Oi 3 Számított: C 40,62, Talált: C 40,21, 39,79, • 2 H2 C0 3 képletre: H6,68, N9,87; H6,96, N9,37; 6,87, 9,49. 9. példa 55 l-[L-(-)^y-Amino-a-hidroxibutiril] kanamicin A monoszulfátjának készítése Egy mól l-[L-(-)-7-amino-a-hidroxibutiril]-kanamicin A-t 1—3 liter vízben oldunk. Az oldatot megszűrjük, hogy eltávolítsuk a fel nem oldott szilárd 60 anyagokat. A lehűtött oldathoz keverés közben 500 ml vízben oldott 1 mól kénsavat adunk. Az elegyet 30 percig kevertetjük, ezt követően hideg etanolt adunk hozzá; csapadékkiválásig. A szilárd anyagot szűréssel elkülönítjük, amely meghatározás után a kívánt mo-65 noszulfátsónak bizonyul. 7
