170340. lajstromszámú szabadalom • Eljárás peptidek előállítására N-hidroxi-5-norbornén-2,3-dikarboximid alkalmazásával
17 170340 18 kentett nyomáson szárazra pároljuk, amikor desztillációs maradékként kristályos anyagot kapunk. A fentiek szerint előállított két terméket 50 ml dimetilformamidban (DMF) oldjuk, az oldathoz 1,1 g HONBI-et adunk, majd lehűtjük. A lehűtött oldathoz 1,3 g diciklohexilkarbodiimidet adunk és jégfürdőben 3 órán át, majd 6 órán át szobahőmérsékleten keverjük. A melléktermékként keletkező diciklohexilkarbamidot szűréssel eltávolítjuk, a szűrletet csökkentett nyomáson bepároljuk. A desztillációs maradékhoz étert adunk, a kivált csapadékot szűréssel elkülönítjük, alaposan mossuk, majd szárítjuk. Mivel az így előállított por alakú termék a következő reakciólépésben közvetlenül felhasználható, szilikagél kromatografáló oszlopon tisztítjuk, eluálóelegyként etilacetát, piridin, ecetsav és víz 30:20:6:10 arányú elegyét használjuk. Az eluátumot csökkentett nyomáson bepároljuk, a desztillációs maradékot éterrel mossuk; vagy úgy járunk el, hogy meleg etanolban oldjuk, etilacetátot adunk hozzá és az elegy lehűtésével kikristályosítjuk a terméket. A kristályos anyagot szűréssel elkülönítjük, amikor 3,10 g (kitermelés: 75%) súlyú terméket kapunk. Vékonyrétegkromatográfiás Rf-értéke (2. eluálóelegy) 0,42; aminosavanalízis: Glu 1,00, His 0,94, Ser 0,96, Tyr 1,01, Gly 1,01, Trp(UV)l,03. 3. A Z-Arg-(N02)-Pro-Gly-NH 2 előállítása 100 ml dimetilformamidban 24,8 g Z—Arg— (N02 )-Pro-OH-t oldunk, az oldatot 0 C° hőmérsékletre hűtjük és 10,7 g HONBI-et és 12,3 g DCC-et adunk hozzá. 6 órán át keverjük a reakcióelegyet, a melléktermékként keletkező diciklohexilkarbamidot szűréssel elkülönítjük. A szűrletet lehűtjük és 7,3 g H—Gly—NH2 —acetátot és 7,7 ml trietilamint adunk hozzá. 8 órán át keverjük a reakcióelegyet, majd a DMF-ot csökkentett nyomáson desztillálva eltávolítjuk és a desztillációs maradékhoz n-butanolt adunk. Ezután telített vizes nátrium-klorid-oldattal mossuk az elegyet. Az n-butanolos fázist csökkentett nyomáson bepároljuk, a desztillációs maradékhoz étert adunk, amikor por alakú terméket kapunk. Ezt etanol és éter elegyéből újra kicsapjuk, így 26,5 g (kitermelés: 96%), 100—116 C° olvadáspontú (bomlik) anyagot kapunk. Elemanalízis a C2i H 30 0 7 N 8 — képlet alapján: számított: C 49,79%; H 5,79%; N 22,12%; mért: C 49,81%; H6,12%; N 21,75%. 4. A Z-Leu-Arg-(N02)-Pro-Gly-NH 2 előállítása 25 ml 25% HBr-ot tartalmazó jégecetben 3,5 g (7 mmólM) Z-Arg-(N0 2)-Pro-Gly-NH 2 -t oldunk. Az oldatot 40 percen át rázzuk, majd 200 ml vízmentes étert adunk hozzá. A keletkező csapadékot szűréssel elkülönítjük, éterrel mossuk és szárítjuk. Az így előállított por alakú terméket 20 ml DMF és 20 ml dioxán elegyében oldjuk, az oldathoz 1,4 ml trietilamint adunk, az egészet félretesszük. 20 ml etilacetát és 20 ml tetrahidrofurán elegyében 2,12 g (8 mmólM) Z-Leu-OH-t és 1,6 g HONBI-et oldunk, az oldatot jégfürdőben lehűtjük és 1,7 g DCC-et adunk hozzá. 30 percen át jégfürdőben keverjük a reakcióelegyet, majd a keverést két órán át szobahőmérsékleten folytatjuk. Ezután a melléktermékként keletkezett karbamidot szűréssel elkülönítjük. A szűr letet csökkentett nyomáson bepároljuk, a száraz desztillációs maradékot 10 ml dioxánban oldjuk. Ezt az oldatot a fenti, amint tartalmazó oldathoz adjuk, és az elegyet egy éjszakán át keverjük. Ezután 5 a dioxán eltávolítására desztilláljuk az elegyet, a desztillációs maradékhoz vizet adunk. Etilacetáttal kétszer extraháljuk a reakcióelegyet, a vizes fázist elkülönítjük és háromszor, egyenként 100—100 ml n-butanollal extraháljuk. Az elkülönített n-butanolos 10 fázist vízzel mossuk, csökkentett nyomáson bepároljuk, a száraz desztillációs maradékot éterrel mossuk és szűréssel elkülönítjük. így 3,8 g, 135—153 C° olvadáspontú (bomlik, nincs jól elválasztható o.p.) anyagot kapunk. 15 Elemanalízis a C27 H 41 O g N 9 képlet alapján: számított: C 52,33%; H 6,66%; N 20,34%; mért: C 52,41%; H6,83%; N 19,97%. A fentiek szerint előállított termék vékonyrétegkromatográfiás Rf-értéke 0,16 (1. oldószereleggyel), 20 0,66 (2. oldószereleggyel), a foltok egységesek és pozitív fehérje-reakciót adnak. 5. A Z-Lys-(IBOC)-Pro-Gly-NH2 előállítása 50 ml acetonitrilben 11,8 g Z-Lys-(IBOC)-OH-diciklohexilamint és 3,6 g H-Pro-OMe—HCl-t ol-25 dunk, az oldatot jégfürdőben lehűtjük és 4,5 g DCC-ot adunk hozzá. 10 órán át keverjük a reakcióelegyet, a melléktermékként keletkező diciklohexilkarbamidot szűréssel elkülönítjük. A szűrletet csökkentett nyomáson bepároljuk, a desztillációs mara-30 dékhoz 150 ml etilacetátot adunk, amikor kismennyiségű karbamid válik ki ismét az oldatból. Ezt ismételten elkülönítjük. Az etilacetátos oldatot ezután 4%-os vizes nátriumhidrogénkarbonát oldattal és 0,1 n sósavval mossuk, majd vizes mosás után vízmentes 35 nátriumszulfáttal vízmentesítjük. Desztillációval eltávolítjuk az oldószert, amikor desztillációs maradékként 9,8 g olajos terméket kapunk. Ezt 40 ml metanolban oldjuk és 20 ml 1 n nátriumhidroxid oldatot adunk hozzá. Az észter elszappanosítására 1 40 órán át keverjük a reakcióelegyet, majd 22 ml 1 n sósavval semlegesre állítjuk be a pH-ját, 100 ml etilacetáttal extraháljuk, a szerves oldószeres fázist vízzel mossuk és vízmentes nátrium-szulfáttal vízmentesítjük. Az etilacetátot ezt követően desztillációval 45 eltávolítjuk, amikor desztillációs maradékként 5,9 g olajos terméket kapunk. Ezt (5 g) 15 ml DMF-ban oldjuk, az oldatot jégfürdőben lehűtjük, majd 1,35 ml trietilamint és 4,45 g triklórecetsavas pentaklórfenilésztert adunk hozzá. 50 percen át szobahőmérsék-50 léten keverjük a reakcióelegyet, majd 1,34 g H—Gly-NH2 -acetátot és 1,5 ml trietilamint adunk hozzá és a keverést további 8 órán át folytatjuk. Ezután étert adunk a reakcióelegyhez, a kivált csapadékot szűréssel elkülönítjük, etanolból újra kicsapjuk, amikor 3,5 g, 55 90—91 C° hőmérsékleten bomlás közben olvadó terméket kapunk; [a]^ = -20,0° (c = 0,5, metanolban). 6. A Z-Leu-Lys-(IBOC)-Pro-Gly-NH2 előállítása 60 50 ml metanolban 3,0 g Z-Lys-(IBOC)-Pro-Gly—NH2 -t oldunk, az oldatot palládium katalizátor jelenlétében hidrogénezzük. 4 órán át tartó hidrogénezés után a katalizátort szűréssel eltávolítjuk és a metanolt ledesztilláljuk. A 65 desztillációs maradékot 15 ml dimetilformamidban 9
