170340. lajstromszámú szabadalom • Eljárás peptidek előállítására N-hidroxi-5-norbornén-2,3-dikarboximid alkalmazásával
170340 19 20 oldjuk, az oldathoz 2,8 g Z-Leu-OPCP-t adunk. 8 órán át keverjük a reakcióelegyet, az oldószert csökkentett nyomáson desztillálva eltávolítjuk, a desztillációs maradékot éterrel mossuk. A kapott por alakú terméket szűréssel elkülönítjük, éterrel mossuk és etanol és éter elegyéből újra kicsapjuk. így 3,0 g (kitermelés: 82,6%), 124-125 C° hőmérsékleten bomlás közben olvadó terméket kapunk; [a]p = -44,2 ° (c = 0,5, metanol). Elemanalízis a C38 H sg 0 8 N 6 képlet alapján: számított: C 62,78%; H 8,04%; NI 1,56%; mért: C 62,64%; H 8,20%; N 11,39%. 7. A BOC-Leu-Orn-(Z)-Pro-Gly-NH2 - előállítása 50 ml dioxánban 6,5 g IBOD-Orn-(Z)-OH-t oldunk, az oldatot jégfürdőben lehűtjük és 1,8 g N-hidroxiszukcinimidet és 3,1 g DCC-et adunk hozzá. 6 órán át keverjük a reakcióelegyet, a melléktermékként keletkező diciklohexilkarbamidot szűréssel eltávolítjuk, a szűrlethez 2,5 g H-Pro-OMe-HCl-ot adunk. Ezután 2,2 ml trietilaminnal egészítjük ki a reakcióelegyet, majd 10 órán át szobahőmérsékleten keverjük. A keverés befejezése után csökkentett nyomáson eltávolítjuk az oldószert. A desztillációs maradékot 150 ml etilacetátban oldjuk, az oldatot 4%-os nátriumhidrogénkarbonát oldattal és 0,1 n sósavval mossuk, majd vizes mosás után vízmentes nátrium-szulfáttal vízmentesítjük. Az etilacetát eltávolítása után desztillációs maradékként kapott 7,0 g súlyú olajos terméket 20 ml metanolban oldjuk, jégfürdőben lehűtjük és 12,5 ml 1 n nátriumhidroxiddal szappanosítjuk. 60 percen át szobahőmérsékleten keverjük az elegyet, majd pH-ját 1 n sósavval semleges értékre állítjuk be. Ezt követően háromszor, egyenként 50 ml etilacetáttal extraháljuk és vízzel mossuk. Az etilacetátos fázisokat vízmentesítjük és csökkentett nyomáson szárazra pároljuk, amikor 2 g olajos desztillációs maradékot kapunk. Az így előállított olaj 1,5 g-ját 10 ml trifluor-ecetsavban oldjuk és 30 percen át keverjük (deizobornil-oxikarbonilezés). Ezután étert adunk a reakcióelegyhez, a kivált csapadékot szűréssel elkülönítjük és éterrel mossuk. Az így elkülönített por alakú terméket 10 ml dimetilformamidban (DMF) oldjuk, az oldatot 0 C° hőmérsékletre hűtjük és 0,6 ml trietilamint, majd 1,04 g BOC-leu-OPCP-t adunk hozzá. 10 órán át szobahőmérsékleten keverjük a reakcióelegyet. A dimetilformamidot csökkentett nyomáson eltávolítjuk, a desztillációs maradékot etilacetáttal extraháljuk. Az extraktumot 0,1 n vizes sósavval és vízzel mossuk, vízmentesítjük, majd az oldószer eltávolítására csökkentett nyomáson desztilláljuk. A desztillációs maradékként kapott olajos anyagot 10 mlDMF-ban oldjuk, az oldatot jégfürdőben lehűtjük és 368 mg HONBI-et, 420 mg DCC-et és 290 mg H-Gly-NH2 -HBr-ot adunk hozzá. 0,26 ml N-etilmorfolin hozzáadása után 8 órán át keverjük a reakcióelegyet. A dimetilformamid eltávolítására csökkentett nyomáson desztilláljuk az elegyet, a desztillációs maradékot etilacetátban oldjuk. Az oldatot 0,1 n sósavval és 4%-os vizes nátrium-hidrogén-karbonáttal mossuk. Vizes mosás után vízmentesítjük az oldatot és csökkentett nyomáson bepároljuk. A száraz desztillációs maradékot petroléterrel kezeljük és szűréssel elkülönítjük, amikor 740 mg (kitermelés: 62%) por alakú, 93—95 C° hőmérsékleten bomlás közben olvadó terméket kapunk; [a]^1 = —33,0° (c = 0,5, metanolban). 8. A H-(Pyr)Glu-His-Trp-Ser-Tyr-Gly-Leu-5 Arg-Pro-Gly-NH2 előállítása 50 ml jégecetben 1,86 g (3 mmólM) Z—Leu— Arg— (N02)-Pro-Gly-NH 2 -t oldunk, az oldatot palládium jelenlétében 20 órán át katalitikusan hidrogénezzük. Ezt követően 7 ml 1 n sósav és jégecet 10 elegyét adjuk az oldathoz és csökkentett nyomáson desztilláljuk. A száraz desztillációs maradékot alapos vízmentesítés céljából nátriumhidroxid felett szárítjuk. 20 ml, 0,1 ml etántiolt és 3 ml 1 n sósav-jégecet 15 elegyét tartalmazó trifluorecetsavban 2,50 g (2 mmólM) H-(Pry)Glu-His-Trp-Ser-Tyr-Gly-OtBu-t oldunk, az oldatot 50 percen át nitrogénáram alatt hagyjuk állni. A trifluore cet savat csökkentett nyomáson eltávo-20 lítjuk, a desztillációs maradékhoz étert adunk. A kivált csapadékot szűréssel elkülönítjük, éterrel alaposan mossuk és nátriumhidroxiddal vízmentesítjük. Az így előállított két vízmentes por alakú terméket 50 ml DMF-ban oldjuk, az oldathoz 0,75 ml N-etil-25 morfolint és 600 mg HONBI-et adunk. Az elegy hőmérsékletét 5 C°-ra állítjuk be és 700 mg DCC-et adunk hozzá. 2 órán át 5 C° hőmérsékleten, majd egy éjszakán át szobahőmérsékleten keverjük a reakcióelegyet. A melléktermékként keletkezett diciklohexil-30 karbamidot szűréssel elkülönítjük és a dimetilformamidot csökkentett nyomáson eltávolítjuk. A desztillációs maradékhoz 50 ml étert adunk. A kivált por alakú terméket szűréssel elkülönítjük és 0,05 mólos vizes ammóniumacetátban oldjuk. Az oldatot Amber-35 lite XAD-II (200-250 mesh) gyantából készült oszlopon kromatografáljuk, az eluálást (grádienseluáció) 0,05 m vizes ammóniumacetáttal és 80%-os etanollal végezzük. Az előállított LH-RG az 50% etanolt tartalmazó frakcióval eluálódik az oszlopról. 40 Ezt az eluátumot elkülönítjük és csökkentett nyomáson bepároljuk. Az etanol eltávolítása után kapott desztillációs maradékot liofilizáljuk, amikor fehér színű porként 2,21 g kromatográfiásan egységes hormont kapunk; [a]g = -43° -49° (c = 0,5, 1%-os 45 ecetsav; a szárítás mértékétől függően változó.) A termék papírkromatográfiás (Toyo Roshi No. 50) Rf -értéke az 5. oldószereleggyel vizsgálva 0,70-0,72. A termék papír-elektroforetikus vizsgálatának 50 eredményei (Toyo Roshi No. 50 papíron): pH 6,5, piridinecetsav, 500 V, 3 óra: Rf(Arg) 0,58-0,60. A termék egységes foltként jelentkezik, amely pozitív Ehrlich-, Sakaguchi és Pauli-reakciót ad. Aminosavanalízis: His 0,98, Arg: 0,97, Glu: 1,00, 55 Ser: 0,96, Pro: 1,08, Gly: 2,00. Leu: 1,03, Tyr: 1,02, Trp (ultraibolya vizsgálat): 1,08. Ha a példa szerinti eljárással előállított hormont szubkután patkányoknak adagoljuk, úgy 40 7/100 g testsúly mennyiségben adva ovuláció indul meg. 60 Intravénás adagoláskor a hatásos mennyiség 20 y/100 g testsúly. Injekciók előállítására 2 liter desztillált vízben 100 mg hormont és 200 g mannitolt oldunk, az oldatot baktérium-mentesítő membránszűrőn szűrjük és 1 ml 65 térfogatú ampullákba töltjük. Az ampullákat liofili-10
