170340. lajstromszámú szabadalom • Eljárás peptidek előállítására N-hidroxi-5-norbornén-2,3-dikarboximid alkalmazásával
23 170340 24 eleggyel vizsgált papírkromatográfiás Rf-értéke 0,20; peptidreakció pozitív. 3. A Z-Ala-Arg-(N02-Pro-Gly-NH 2 előállítása A 16. példa 6. pontja szerinti eljárást megismételve Z-Arg-(N02 )-Pro-Gly-NH 2 -bői H-Arg-(N0 2 )Pro-Gly-NH2 -t állítunk elő. Ez utóbbit az N-hidroxiszukcinimides eljárással Z—Ala—OH-nal kondenzáljuk. Ezf követően éterrel egészítjük ki a reakcióelegyet, a keletkezett csapadékot kloroform és etilacetát elegyél) ől újra kicsapjuk, amikor 84,8 %-os kitermeléssel Z-Ala-(N02)-Pro-Gly-NH 2 -t kapunk. Az 1. oldószereleggyel kivitelezett vékonyrétegkromatográfiás vizsgálat szerint a termék egységes és 0,10-es Rf -értékkel jellemezhető. 4. Az IBOC-Val-Arg-(N02 )-Pro-Gly-NH 2 előállítása 450 mg Z-Arg-(N02 )-Pro-Gly-NH 2 -t 25 %-os hidrogénbromidos jégecet eleggyel kezelünk oly módon, hogy 50 percen át keverjük a reakcióelegyet. Ezt követően étert adunk hozzá, a kivált csapadékot, a H-Arg-(N02 )-Pro-Gly-NH 2 -HBr-ot 5 mlDMF-ban oldjuk, az oldathoz 0,14 ml N-etilmorfolint adunk. Ezután 320 mg IBOC-val-OH-ból előállított IBOC-val—ONBI-et adunk a reakcióelegyhez és 2 napon át szobahőmérsékleten keverjük. Ezt követően étert adunk az elegyhez, a kivált csapadékot szűréssel elkülönítjük és kloroformban oldjuk. Az oldatot 4%-os vizes nátrium-hidrogén-karbonát-oldattal és vízzel mossuk, és a kloroformos fázist elkülönítve magnézium-szulfáttal vízmentesítjük, majd csökkentett nyomáson bepároljuk. így 330 mg (kitermelés: 60%), az 1. oldószereleggyel vizsgálva 0,24-es papírkromatográfiás Rf -értékkel jellemezhető terméket kapunk. 5. A Z-Ile-Arg-(N02)-Pro-Gly-NH 2 előállítása Ezen példa 1. pontja szerint eljárva, a Z—Arg— (N02 )-Pro-Gly-NH 2 hidrogénbromidos-jégecetes kezelésével előállítható H—Arg— (N02)-Pro—Gly— NH2 -ből kiindulva Z-Ile-ONBI-del állítjuk elő a kívánt terméket. Az eljárás végén 77,0%-os kitermeléssel különíthető el a tiszta tetrapeptidszármazék, amely a kromatográfiás vizsgálat szerint egységes anyag, és az 1. oldószereleggyel vizsgálva 0,17-es, míg a 2. oldószereleggyel vizsgálva 0,68-as Rf-értékkel jellemezhető. 6. A H-(Pyr)Glu-His-Trp-Ser-Tyr-Gly-Arg-Pro-Gly-NH2 előállítása H-(Pyr)Glu-His-Trp-Ser-Tyr-Gly-OfBu-t (488 mg) 0,5 ml 5 n sósavval és 10 ml, jégecetet tartalmazó trifluorecetsawal kezelünk a szokásos módon, amikor a t-butilészter-csoport lehasad a molekuláról és száraz porként szabad vegyületet kapunk. 2 ml trifluorecetsavban 366 mg IBOC-Gly—Arg— (N02)-Pro-Gly-NH 2 -t oldunk, az oldatot 30 percen át keverjük, majd 0,1 ml 6,67 n sósav-dioxán elegyet adunk hozzá. Csökkentett nyomáson bepároljuk az elegyet, a desztillációs maradékhoz étert adunk. A kivált csapadékot szűréssel elkülönítjük és szárítjuk. A fentiek szerint előállított két por alakú terméket 5 ml DMF-ben oldjuk, az oldathoz 0,17 ml trimetilamint, 129 mg HONBI-et és 148,6 mg DCC-et adunk. 24 órán át keverjük a reakcióelegyet. A melléktermékként keletkezett diciklohexilkarbamidot szűréssel, a DMF-ot csökkentett nyomáson, desztillációval eltávolítjuk. A desztillációs maradékhoz etilacetátot adunk, a kivált csapadékot szűréssel elkülönítjük és 5 etanol és etilacetát elegyéből ismételten kicsapjuk, így 1,0 g terméket kapunk; ez [Gly7 -Arg-(N0 2 ) 8 ]LH-RH. 150 mg fenti végterméket 0,1 ml anizollal és 0,05 ml metántionnal nedvesítünk, majd 10 ml vízmentes 10 hidrogénfluoridban oldunk. 60 percen át hűtés közben keverjük a reakcióelegyet. Ezt követően a hidrogénfluoridot desztillációval eltávolítjuk, a desztillációs maradékot nátriumhidroxiddal szárítjuk. A száraz terméket vízben oldjuk és éterrel extraháljuk. Az 15 extraktumot Amberlite IRA-400 (acetát) kromatografáló oszlopon engedjük át, majd a kromatografálást Amberlite XAD—II gyantával megismételjük. Eluensként észtert használunk. Az UV aktív hatóanyagot tartalmazó frakciókat 20 összegyűjtjük, csökkentett nyomáson bepároljuk és szárítjuk. így 107 mg (Gly7 )-LH-RH-t kapunk; [a]g = -40P° ± 4° (c = 1,0,5% ecetsavban). Aminosavanalízis: Ser 0,91, Glu 0,87, Pro 0,93, Gly 3,00, Tyr 1,01, His 1,10, Arg 1,15, Trp (ultraibo-25 lya)l,03. Elemanalízis a Csl H^ Oi 2 N 17 • 3CH 3 COOH • 8H2 0- képlet alapján: számított: C 48,92%; H 6,63%; N 17,02%; mért: C 48,70%; H 6,39%; N 16,92% 30 7. A H-(Pry)Glu-His-Trp-Ser-Tyr-Gly-Phe-Arg—Pro—Gly— NH2 előállítása A Z-Phe-Arg-(N0 2)-Pro-Gly-NH 2 -t a szokásos eljárással, palládium jelenlétében katalitikusan hidrogénezzük, amikor a Z-csoport lehasad a moleku-35 Iáról. A kapott H-Phe-Arg-Pro-Gly-NH2 • 2HC1 91,1 mg-ját és (Pyr)Glu-His-Trp-Ser-Tyr-Gly-OH—HCl-ot 12 ml dimetilformamidban oldunk, az oldathoz 36 mg HONBI-et és 0,44 ml 10% N-etilmorfolint tartalmazó DMF-ot adunk. Az oldatot 0 C° 40 hőmérsékletre hűtjük és 41 mg DCC-et adunk hozzá. 4 órán át 0 C° hőmérsékleten keverjük a reakcióelegyet, majd a keverést 8 órán át szobahőmérsékleten folytatjuk. Ezután 15 ml etilacetátot adunk az elegyhez, a kivált csapadékot szűréssel elkülönítjük, 45 etilacetáttal mossuk, szárítjuk és vízben oldjuk. A nem oldódó melléktermékeket szűréssel elkülönítjük, a szűrletet 1,5X22 cm méretű Amberlite XAD-II kromatografáló oszlopon engedjük át. A hatóanyagot 5-70% etanolt tartalmazó eleggyel eluáljuk (grá-50 diens). A (Phe7 )-LH-RH-t tartalmazó eluátumot összegyűjtjük és desztilláljuk. A desztillációs maradék liofilezésével 82 mg tiszta végterméket kapunk. Aminosavanalízis: His 0,93, Arg 0,93, Ser 0^7, Glu 1,00, Pro 1,03, Gly 2,00, Tyr 1,00, Phe 0,97, Trp 55 (ultraibolya analízissel) 0,98. 8. A H-(Pyr)-Glu-His-Trp-Ser-Tyr-Ala-Arg-Pro-Gly—NH2 előállítása Ezen példa 7. pontjában ismertetett eljárással Z-Ala-Arg-(N02)-Pro-Gly-NH 2 és (Pyr)Glu-60 Hiss—Trp—Ser—Tyr—Gly—OtBu reakciójával állítjuk elő a fenti vegyületet. A nyersterméket karboximetilcellulóz kromatografáló oszlopon, gradiens eluálással (0,005—0,1 mólos ammóniumszulfát puffer, pH 6,8) tisztítjuk. A termék optikai forgatóképessége [ajg = 65 -48,2° (c = 0,35, 5%-os ecetsav); az 5. oldószer-12
