170334. lajstromszámú szabadalom • Eljárás mikroorganizmusok tenyésztésére
170334 3 4 egy (az NCIB 11 021 letéti számú törzs) a Curtobacterium nemzetséghez tartozik. Hangsúlyozzuk, hogy a metanolt hasznosító új mikroorganizmusokat, így például a JMS 72 jelű vegyes tenyészet metanolt hasznosító komponensét metanolt nem hasznosító mikroorganizmusok távollétében is tenyészthetjük, e tiszta tenyészetek alkalmazásával azonban kevésbé kedvező ered meny ékhez jutunk, mintha vegyes tenyészeteket használnánk fel. A másik módszerrel a vegyes tenyészeteket úgy alakítjuk ki, hogy egy vagy több ismert, metanolt hasznosító mikroorganizmus-törzset egy vagy több ismert, metanolt nem hasznosító mikroorganizmustörzzsel keverünk össze. Nyilvánvaló, hogy a metanolt hasznosító mikroorganizmus-törzsnek egy vagy több olyan anyagot kell termelnie vagy felszabadítania, amely(ek) elősegíti(k) a metanolt nem hasznosító mikroorganizmusok növekedését. A folyékony táptalaj előnyösen 1—200 g/l, célszerűen 20—100 g/l metanolt tartalmazhat. A táptalaj metanolon kívül asszimilálható nitrogénforrást tartalmaz. Az asszimilálható nitrogénforrások nitrogéntartalmú vegyületek, például ammónia, ammóniumsók (így ammónium-szulfát vagy -klorid), karbamid vagy nitrátok (például alkálifém-nitrátok) lehetnek. A nitrogéntartalmú vegyületek koncentrációja előnyösen 3--50 g/l lehet. A táptalaj továbbá foszfort, ként, magnéziumot és vasat tartalmaz, esszenciális fémsók formájában. A foszforforrás előnyösen egy vagy több foszfát, például K2 HP0 4 , KH 2 P0 4 , Na 2 HP0 4 , NaH 2 P0 4 , (NH4 ) 2 HP0 4 vagy foszforsav lehet; e vegyületeket a táptalaj előnyösen 3—20 g/l koncentrációban tartalmazza. Kénforrásként például kénsavat vagy szulfátokat, így ammónium-szulfátot alkalmazhatunk, célszerűen 0,5-5.0 g/l mennyiségben. A magnéziumot és a vasat sóik formájában juttatjuk a táptalajba. A táptalaj például 0,2-2,0 g/l MgS04 -7H 2 0-t és 0,01-0,1 g/l FeCl3 -6H 2 O-t tartalmazhat. A táptalaj továbbá nyomnyi mennyiségben egyéb elemeket (például kalciumot, mangánt, cinket, kobaltot, molibdént, és bórt) is tartalmazhat, a megfelelő sók formájában. A legcélszerűbb táptalaj-összetételeket az 1—4. példákban közöljük. A találmány szerinti eljárást szakaszos, félig folyamatos vagy teljesen folyamatos üzemben hajthatjuk végre. Folyamatos üzemvitel esetén a termelést szakaszosan indíthatjuk be, vagy a 803 018 sz. belga szabadalmi leírásban ismertetett, gyorsított beindítási módszert alkalmazhatjuk. A nyugalmi állapot elérésekor a folyamatos tenyésztést úgy biztosítjuk, hogy a mikroorganizmust folyamatosan elkülönítjük a növekvő tenyészettől, és ugyanakkor friss közeg folyamatos adagolásával a tenyészet térfogatát állandó értéken tartjuk. A folyamatos tenyésztés során a növekvő tenyészet felső folyadékfázisában — a tenyészetbe táplált közeg metanoltartalmától függetlenül — a metanol koncentrációját a növekedést biztosító határértéken tartjuk. Ez a koncentráció előnyösen kis, célszerűen 0,01 térfogat%-ot meg nem haladó érték. A mikroorganizmus tenyésztését megfelelő felépítésű fermentációs berendezésekben, például kevert, zárt fermentorban vagy permetezőberendezéssel felszerelt fermentációs toronyban végezhetjük. A fermentorok hűtését belső hűtőberendezéssel vagy külső recirkulációs hűtőkígyóval biztosítjuk. A tenyészetet levegővel, oxigénnel, vagy oxigénnel dúsított levegő-5 vei levegőztethetjük. A tenyésztést 30—50 C°-on, előnyösen 38—45 C°-on végezzük. A tenyészet pH-ját adott esetben lúg, például nátrium-hidroxid, kálium-hidroxid vagy ammónium-hidroxid és/vagy sav, például kénsav vagy 10 foszforsav beadagolásával 6,0 és 8,0 közötti értéken, előnyösen 6,4 és 7,4 értéken tartjuk. A mikroorganizmus-sejteket tetszés szerinti ismert módszerrel különíthetjük el a táptalajtól, így például flokkulálást, ülepítést és/vagy kicsapást, majd azt 15 követő centrifugálást és/vagy szűrést alkalmazhatunk. A kapott biomasszát ezután például fagyasztással vagy porlasztással szárítjuk, és ebben a formában emberi és állati táplálkozásra alkalmas tápanyagként vagy tápanyag-kiegészítésként használjuk fel. 20 A találmány szerinti eljárást az oltalmi kör korlátozása nélkül az alábbi példákban részletesen ismertetjük. 1. példa 25 A vegyes tenyészetek elkülönítése E példában három különböző módszert ismertetünk a vegyes tenyészetek elkülönítésére a megfelelő forrásokból. Mindegyik eljárásváltozatban növesztő táptalajként az alábbi összetételű, DCR2 jelű táptalajt 30 alkalmazzuk: metanol 5-50 g/l Na2 HP0 4 3,0 g/l KH2 P0 4 3,0 g/l (NH4 ) 2 S0 4 4,5-9,0 g/l Na-citrát 0,125 g/l MgS04 -7H 2 0 0,50 g/l FeCl3 '6H 2 0 0,167 g/l CaCl2 -H 2 0 0,66 mg/l ZnS04 -7H 2 0 0,18 mg/l CuS04 -7H 2 0 0,16 mg/l MnS04 -4H 2 0 0,15 mg/l CoCl2 -6H 2 0 0,18 mg/1 H3BO3 0,10 mg/l Na2 Mo0 4 -2H 2 0 0,30 mg/l víz adl liter A közeg pH-ját megfelelő mennyiségű lúg, például nátrium-hidroxid beadagolásával 6,8-ra állítjuk be. (a) Rázólombikos módszer: 250 ml-es rázólombikokba 100 ml DCR2 táptalajt, 50 0,1 térfogatrész metanolt és 5 mikroorganizmusforrást töltünk, és a lombikokat 200 fordulat/perc sebességű rázás közben 42 C°-on inkubáljuk. Amikor a tenyészet a mikroorganizmus növekedése közben zavarossá válik, a tenyészet 5 ml-es mintáját egy 100 55 ml DCR2 táptalajt és 0,1 térfogatrész metanolt tartalmazó második rázólombikba visszük át. Ezt a műveletet addig ismételjük, amíg jó, reprodukálható növekedést nem tapasztalunk. Az így kapott tenyészeteket használjuk fel a további tenyésztések oltó-60 anyagaiként. Ezzel a módszerrel különíthetjük el a BM 42 jelű tenyészetet egy Burundi-ban (Afrika) levő természetes hőforrás mellől vett iszapmintából. (b) Kemosztatikus módszer: 2,4 liter hasznos térfogatú, laboratóriumi méretű 65 fermentorba 6,8 pH-értékű DCR2 táptalajt töltünk. A
