170334. lajstromszámú szabadalom • Eljárás mikroorganizmusok tenyésztésére
170334 5 6 táptalajt 42 C°-on 300-1000 fordulat/perc sebességgel keverjük, és 2 liter/perc sebességgel levegőztetjük. A fermentor tartalmát 100 g mikroorganizmusforrással beoltjuk, és 0,5 térfogat% metanolt adunk hozzá. Amikor a tenyészet zavarossága fokozódik, a fermentorba további 0,5 térfogat% metanolt adagolunk. A zavarosság további fokozódásakor a fermentorba folyamatosan, 0,08/óra hígítási arányban 1 térfogat% metanolt tartalmazó DCR2 táptalajt adagolunk. Amikor a nyugalmi állapotot elértük — amit a tenyészet optikai sűrűségének állandósulása jelez —, a hígítási arányt fokozatosan 0,2/órára növeljük. Ezzel az eljárással különítjük el a JMS 72 jelű tenyészetet egy Sittingbourne-i (Kent, Anglia) szennyvízcsatorna kifolyójánál vett mintából. (c) Turbidosztatikus módszer: Ennél az eljárásmódnál a fermentáció körülményeit úgy szabályozzuk, hogy csak a leggyorsabban növekedő mikroorganizmus növekedését segítsük elő, míg a további, lassabban növekedő mikroorganizmusokat kimossuk. Ennek biztosítására megfelelő növekedésjelző készülékkel (lásd: Norris és munkatársai: „An automatic growth recorder for microbial cultures", „Automation, mechanisation and data handling in microbiology", kiadó: Brillie és Gilbert, Academic Press, 1970, 151-161. oldal) folyamatosan ellenőrizzük a fermentorban levő tenyészet optikai sűrűségét. A növekedésjelző készülék automatikus kapcsolóval csatlakozik a táptalajszivattyúhoz. Ha az optikai sűrűség túllép egy előre meghatározott értéket, a kapcsoló bekapcsolja a táptalaj-adagolást, míg ha az optikai sűrűség a megadott érték alá csökken, a kapcsoló automatikusan kikapcsol. 5 g mikroorganizmus-forrást az (a) pontban leírtak szerint inkub álunk. Amikor a tenyészetben baktériumnövekedésnek tulajdonítható zavarosodás lép fel, a tenyészetet a durva részecskék eltávolítása érdekében szűrjük, majd a szűrietet oltóanyagként használjuk. A turbidosztatikus berendezésbe 1 térfogat% metanolt tartalmazó DCR2 táptalajt töltünk. A tenyésztést 42 C°-on, 6,8 pH-értéken végezzük. Ezzel az eljárással különítjük el az ST 42 jelű tenyészetet egy Sittingbourne-ban (Kent, Anglia) vett korhadó növénymintából. E tenyészet elkülönítése során az optikai sűrűséget körülbelül 3 g mikroorganizmus-szárazanyag/liternek megfelelő értéken tartjuk. 3 napos tenyésztés után a tenyészet kétszereződési ideje 1,6 óra. 2. példa Egy tipikus vegyes tenyészet (JMS 72 jelű tenyészet) elkülönítése és jellemzői Az 1. példa (b) módszere szerint előállított JMS 72 jelű vegyes tenyészetből 1 ml-es mintákat veszünk, a mintákat kis üveglombikokba helyezzük, és metanolt nem tartalmazó DCR2 táptalajjal a fermentorban észlelhető koncentráció 10~6, 10 —7 , illetve 10~ 8 szorosára hígítjuk. A lombikokból 0,1 ml térfogatú mintákat különítünk el, és a mintákat (a) DCR2 táptalajjal kiegészített agarlemezekre, illetve (b) Lab Lemco táptalajjal kiegészített agarlemezekre permetezzük. Minden egyes agarlemezt fedővel borítunk le. DCR2 táptalaj használata esetén a fedőre kevés metanolt helyezünk. Ezután a lemezeket megfordítjuk, és 48 órán át 42 C°-on inkubáljuk. Ez idő elteltével a lemezeket megvizsgáljuk. A DÍJR2 táptalajt tartalmazó lemezeken egyetlen (EN jelű; mikroor ganizmus, míg a Lab Lemco táptalajt tartalma/ó lemezeken négy (MU, FG, YL és GR jelű) mikroorgu-5 nizmus növekedik. A lemezekről platinakacs segítségével egyedi mikroorganizmus-telepeket különítünk el, és a megfelelő növesztő táptalajt tartalmazó friss lemezekre helyezzük. A mikroorganizmusokat növekedni hagyjuk. így 10 az egyes mikroorganizmusok tiszta tenyészeteihez jutunk. A JMS 72 tenyészetből elkülönített öt mikroorganizmust nemzetségbeli hovatartozásuk meghatározása érdekében az 1. táblázatban felsorolt standard vizsgá-15 latoknak vetjük alá. A vizsgálatokat az alábbi szakkönyvek ismertetik: „Manual for the Indentification of Medical Bacteria" S. T. Cowan és K. J. Steel, Cambridge University Press (1966), 20 „Bogey's Manual of Determinative Bacteriology" 7. kiadás, Williams and Wilkins (1959), „A Guide to the Identification of the Genera of Bacteria", V. B. D. Skerman, 2. kiadás, Williams and Wilkins (1967). 25 Egyes vizsgálatokra az idézett szakkönyvek több alternatív módszert ajánlanak. Az alternatív módszerek közül a következőket választottuk a vizsgálat céljaira: 30 9. Oxidázvizsgálat: Kovács, 1956 13. Növekedés KCN-táptalajon: Rogers és Taylor (1961) által módosított Moller-módszei (1954) 18. Lizin-dekarboxiláz: oxoid táptalaj, Moller, 1955 19. Arginin-dihidroláz: oxoid táptalaj, Moller, 1955 35 20. Ornitin-dekarboxiláz: oxoid táptalaj, Moller, 1955 21. Zselatin hidrolízis: Kohn, 1953 22. Indol-termelés: Kovács-reagens, 1928 23. Voges-Proskauer teszt: Barritt, 1936 24. H2 S-termelés: hármas cukor-vas agar 40 25. Ureáz-termelés: oxoid táptalaj, Christensen táptalaj, 1946 26. Citrát-hasznosítás: növesztés Simon-féle citrát ferde tenyészeten, fixáJás Koser-táptalajjal 28. Nitrátredukció: nitrit kimutatása keményítő-jodid 45 foltreakcióval Az egyes kísérletek eredményeit az 1. táblázatban közöljük. A táblázatban a „+" jel pozitív reakciót, míg a ,,-" jel negatív reakciót jelent. A vizsgálatok 50 eredményei szerint a vizsgált mikroorganizmusok közül négyet a következő nemzetségekbe sorolhatunk: MU Pseudomonas sp. NCIB No. 11019 55 FG Curtobacterium NCIB No. 11021 YL Pseudomonas sp. NCIB No. 11022 GR Acinetobacter NCIB No. 11020 A metanolt hasznosító EN jelű mikroorganizmust (NCIB No. 11040) az 1. táblázatban feltüntetett 60 sajátságai alapján egyetlen ismert mikroorganizmusnemzetségbe sem sorolhatjuk be megfelelő pontossággal. A mikroorganizmusok ismert antibiotikumokra adott reakcióit is megvizsgáltuk. E kísérletek eredmé-65 nyeit a 2. táblázatban közöljük. 3
