170264. lajstromszámú szabadalom • Eljárás az S-adenozil-L-metionin szulfonsavsóinak előállítására
170264 9 10 majd a reakció befejeződése után a gélt desztillált vízzel, 8,5 pH-jú puffereleggyel, végül pedig 4,5 pH-jú puffereleggyel mossuk. Az így kapott géllel ezután megtoltunk egy 1,5 cm átmérőjű és 30 cm magas oszlopot. Az oszlopon ezt követően 8,0 pH-jú, 0,05 5 mól trietil-amint és 0,01 mól kénsavat tartalmazó pufferelegyet bocsátunk át az egyensúly eléréséig. Az oszlopra ezután olyan, a specifikus enzimet tartalmazó 2 ml-nyi élesztőextraktumot viszünk fel, amelyet ultrahangos kezelés vagy szárazjéggel végzett 10 homogenizálás, illetve lehetőség szerint a specifikus enzim feldúsítása útján kaptunk. Az oszlopot ezután ugyanazzal a puffereleggyel eluáljuk, amelyet az egyensúly beállításához használtunk. Ezt követően a fehérjék eloszlását az eluátum frakcióiban ibolyántúli 15 spektrofotometriával vizsgáljuk, illetve ezzel egyidejűleg az enzim aktivitását Stekol, J. A. módszerével [Methods in Enzimology, 6. kötet, 566. o. (1963)] mérjük. Az enzimet tartalmazó frakciókat ezután összeöntjük. Az így kapott oldat aktivitása a kündu- 20 lási nyers extraktum aktivitásának legalább húszszorosa. Az enzim az oldatban tovább koncentrálható sókkal vagy szerves oldószerekkel végzett kicsapás, vagy fehérjeoldatok töményítésére ismert más módszer felhasználása útján. 25 SAM előállítása 30 ml darabos Sepharose-gélt brómciánnal vagy fehérjék poliszacharid-gélmátrixokhoz kötésére alkalmas bármely más ismert módszerrel aktiválunk. Az aktivált gélhez ezután az előzőekben ismertetett 30 módon tisztított enzim oldatából 4 ml-t — amely közel 100 mg enzimet tartalmaz — adunk. Az aktivált gélből és az enzimoldatból álló szuszpenziót ezután 4 °C-on 18 órán át keverjük, majd a gélt vízzel mossuk. Ez a vizes mosófolyadék az enzimoldat eredeti összes 35 enzimaktivitásának közel 70%-át tartalmazza. Ha az így kezelt Sepharose-gélt inkubáljuk az enzimaktivitás meghatározása céljából, akkor megállapítható, hogy az eredeti összaktivitás közel 20%-a van kötve a poliszacharidhoz. 40 Az így kezelt Sepharose-géllel ezután megtoltunk egy 1,5 cm átmérőjű és 20 cm magas oszlopot, majd az oszlopon 25-27 °C-on 5 ml/óra átfolyási sebességgel 0,675 mól trietanol-amint, 0,150 mól magnéziumszulfátot, 0,05 mól ATP-t, 0,05 mól metionint és 45 0,01 mól kálium-kloridot tartalmazó oldatot bocsátunk át. Az oszlopot elhagyó eluátum a SAM-tartalomra elvégzett analízis tanúsága szerint 30%-os konverziónak megfelelő mennyiségű SAM-ot tartalmaz. 50 SAM-4-klór-benzolszulfonsavsójának előállítása. Az előző részben kapott, 6 g/liter SAM-ot tartalmazó eluátumból 103 ml-hez annyi kénsavat adunk, míg pBja 3,0-ra beáll, majd ezután 2,3 g pikrolonsav 55 25 ml metil-etil-ketonnal készült oldatát adjuk a megsavanyított eluátumhoz. Egy éjszakán át a kapott keveréket állni hagyjuk, majd a kivált csapadékot kiszűrjük és vízzel mossuk. A csapadékot ezután újra oldjuk 6,2 ml 1 n 60 2-metoxietanolos 4-klór-benzol-szulfonsav-oldatban, majd a kapott oldathoz 50 ml toluolt adunk. A kivált csapadékot elkülönítése után feloldjuk 12,5 ml 0,25 n 2-metoxietanolos 4-klór-benzol-szulfonsav-oldatban, majd az oldathoz színtelenítő aktív szenet adunk. A í 65 keveréket ezután szűrjük, majd a szűrlethez 60 ml kloroformot adunk. így 1,43 g sót kapunk. A só több mint 20% mennyiségben oldódik vízben, ugyanakkor a szokásosan használt szerves oldószerekben rosszul oldódik. Az elvégzett vékonyréteg-kromatográfiás vizsgálat tanúsága szerint mentes bármiféle szennyeződéstől. Analitikai adatait az I. táblázatban adjuk meg. Ezek szerint tapasztalati képlete: CiS H 23 N 6 O s S • 3C 6 H 5 C103 S. A sót azonosítottuk továbbá az 1. példában ismertetett enzimatikus módszerrel is. A fentiekben ismertetett módon eljárva, de 4-acetil-benzolszulfonsavat, 2-benzoldiszulfonsavat, 4-bifenilszulfonsavat, 2-mezitilénszulfonsavat és 5-szulfoszalicilsavat használva az alábbi tapasztalati képletű sókat kapjuk: C1S H 23 N 6 Ö 5 S • 3C 8 H 8 0 4 S; C 1S H 23 N 6 0 S S • • 1,5Q-H6 0 6 S 2 ; C15 H 23 N 6 0 5 S • 3Ci 2 H 10 0 3 S; C 1S H 23 N 6 0 5 S • •3C9 H 12 0 3 S; Cls H 23 N 6 O s S-3C 7 H 6 0 6 S. Ezeknek a sóknak az analitikai adatait az I. táblázatban részletezzük. 5. példa Az 1. példa szerinti kündulási oldat 70 literjéből pikrolonsawal kicsapott csapadékot szobahőmérsékleten keverés közben feloldjuk 3,1 liter 1 n metanolos 1,2-etán-diszulfonsav-oldatban, majd a kapott oldathoz 25 liter acetont adunk. A kivált csapadékot ezután újra oldjuk 12,5 liter 0,25 n metanolos 1,2-etán-diszulfonsav-oldatban, majd a kapott oldathoz színtelenítő aktív szenet adunk. A keveréket ezt követően szűrjük, majd a szűrlethez 60 liter metil-izobutil-ketont adunk. így 546 g sót kapunk. A só több mint 20% mennyiségben oldódik vízben, ugyanakkor a szokásosan használt szerves oldószerben rosszul oldódik. Az elvégzett vékonyréteg-kromatorgráfiás vizsgálat tanúsága szerint mentes bármiféle szennyeződéstől. A só analitikai adatait az I. táblázatban adjuk meg. Tapasztalati képlete.ÇiS H 23 N 6 0 5 S • 2C 2 H 6 0 6 S 2 A sót azonosítottuk az 1. példában ismertetett enzimatikus módszerrel is. 6. példa Az 1. példa szerinti kiindulási anyag 70 literjéből pikrolonsawal kicsapott csapadékot szobahőmérsékleten keverés közben feloldjuk 3,1 liter 1 n etanoíos 2-hidroxi-etánszulfonsav-oldatban, majd a kapott oldathoz 25 liter metil-izobutil-ketönt adunk. A kivált csapadékot újra oldjuk 12,5 liter 0,25 n etanoíos 2-hidroxi-etänszulfonsav-oldätbah, majd az oldathoz színtelenítő aktív szenet kapunk. Az így kapott keveréket ezután szűrjük, majd a szűrlethez 80 liter tetrahidrofuránt adunk. így 632 g sót kapunk. A só vízben több mint 20% mennyiségben oldódik, ugyanakkor a szokásosan használt szerves oldószerekben rosszul oldódik. Az elvégzett vékonyréteg-kromatográfiás vizsgálat tanúsága szerint a só mentes bármiféle szennyeződéstől. Analitikai adatait az I. táblázatban adjuk meg. Tapasztalatai képlete: C15 H 23 N 6 O s S • 4C 2 H 6 0 4 S. A sőt azonosítottuk az 1. példában ismertetett enzimatikus módszerrel is. < 5
